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摘 要: 为探讨培养基 ISO 国际标准对国内培养基质控的等效性, 选择国内外 4 家培养基生产厂家的霉菌培养基、酵母菌培养基和显色培养基, 从质控菌株生长率、抑菌效果等方面进行质量分析比对试验。生长率质控标准菌株在各种霉菌培养基、酵母菌培养基上的生长率均值均大于 0.5,在显色培养基上的生长率均值均大于 0.7, 符合 ISO 国际标准。经统计分析, 试验的 4 家培养基厂家生产的培养基质量水平差异不显著(P > 0.05), 这为将新出台的培养基国家标准拟等效采用培养基 ISO 国际标准提供了基础材料和依据。

关键词: 培养基, 生长率, 抑菌效果, 质量, 食品卫生

培养基是当前我国乃至全球微生物检验经典方法中所必须采用的生化试剂, 其质量好坏直接影响实验结果。目前我国还没有一个系统的且适合我国食品卫生微生物学待检测现实的培养基质量控制标准, 以致各相关单位采用的标准不一致, 影响了检验结果的可比性与稳定性[1]。我国拟基本采用 ISO培养基标准内容与结构, 综合参考国内外已有的相关培养基标准制定的食品卫生微生物学检验培养基质量控制的国家标准即将出台[2 14]。本文以 ISO 的培养基质控方法[11,12]——定量的生长率试验和定性的选择性试验, 以国外专业培养基厂家的培养基作为对照培养基, 对国内外 4 家培养基生产厂家生产的用于霉菌和酵母菌检验[15]的孟加拉红琼脂培养基、PDA、OGY(Oxytetracycline glucose yeast extractAgar, 土霉素葡萄糖酵母抽提物琼脂培养基 ) 和Yeast dextrose chloramphenicol agar(酵母葡萄糖氯霉素琼脂培养基), 以及 Aliz-gal 琼脂培养基、大肠菌群显色培养基、大肠杆菌显色培养基、蜡样芽孢杆菌显色培养基等显色培养基进行了微生物生长率方面的质量比对, 为培养基国标的制订提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

1.1.1 生长率质控标准菌株: 酿酒酵母(Saccharo-myces cerevisiae) ATCC 9763、白色念珠菌(Canidiaalbicans) ATCC 10231、桔青霉(Penicillium citrinum)AS 3.2788、黑曲霉(Aspergillus flavus) ATCC 16404、大肠埃希氏菌(Escherichia coli) ATCC 25922、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes) CMCC(B) 45103、柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii) ATCC 8090、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus) CMCC(B) 63303。

1.1.2 选择性质控标准菌株 : 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 6538、大肠埃希氏菌(Escherichia coil) ATCC 25922、粪链球菌(Enterococcusfaecals) CMCC(B) 32223、粪肠球菌 (Enterococcusfaecals) ATCC 29212、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC(B) 63501。

1.2 培养基

孟加拉红琼脂培养基和 PDA 分别由广东环凯微生物科技有限公司(广州)、北京陆桥技术有限责任公司(北京)、中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心(上海)和 Oxoid(英国)提供, 分别编号为 A、B、C、D, OGY 由 Oxoid 提供, Yeast dextroseChloramphenicol agar 由中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心提供, Aliz-gal 琼脂培养基、大肠菌群显色培养基、大肠杆菌显色培养基和蜡样芽孢杆菌显色培养基由广东环凯微生物科技有限公司(广州)提供, 以 Oxoid 提供的沙氏葡萄糖琼脂培养基和BD(美国)提供的胰蛋白胨大豆琼脂培养基作为对照培养基[12]。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液制备: 取试验菌株培养物少许, 通过血细胞计数板计数分别制成 104C F U / m L ~106CFU/mL 的活菌悬液, 依次作 10 倍递减稀释液,制备成一系列菌浓度不同的菌悬液, 待用[16]。

1.3.2 培养基制备: 分别将 4 家培养基按要求称量,溶于一定量的蒸馏水中, 1.01 MPa 灭菌 15 min。

1.3.3 培养基检验: 取 3 个适宜稀释度的菌悬液1 mL 于灭菌平皿中, 每个稀释度做 2 个平皿, 倾注培养基, 混匀, 待琼脂凝固后倒置于 25°C~28°C 培养箱培养, 3 d 后开始观察计数, 计算生长率, 共培养观察 5 d。阴性对照组以 1 mL 0.85%生理盐水代替菌悬液。试验重复 3 次。

1.3.4 生长率: 将适量生长率质控标准菌株分别接种至测试培养基及对照培养基中, 比较两者菌落总数的比值, 采用定量的方法评价培养基的微生物学性能。生长率 PR的计算见式(1)。

PR=0NNs(1)式中:

NS——从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数;N0——从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数(该菌落总数应≥100 CFU)。

参照 ISO 等标准, 合格霉菌和酵母菌培养基上质控标准菌株的生长率不得低于0.5, 合格显色培养基上的质控标准菌株的生长率不得低于 0.7[12]。

1.3.5 选择性: 在选择性培养基的定性试验中, 选择性质控标准菌株的生长应该全部被抑制。

2 结果

2.1 霉菌培养基、酵母培养基的质量比对研究计数生长率质控标准菌株酿酒酵母、白色念珠菌、桔青霉、黑曲霉在霉菌培养基以及酵母培养基和对照培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落数,生长率均值均大于 0.5, 符合 ISO 国际标准; 选择性质控标准菌株金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌的生长全部被抑制; 各培养基的阴性对照均未长菌。对质控标准菌株在国内外 4 个厂家的孟加拉红琼脂培养基、PDA 上的生长率经 Levene 方差齐性检验, 结果差异不显著(P > 0.05), 即酿酒酵母、白色念珠菌、桔青霉、黑曲霉于国内外 4 家不同厂家生产的孟加拉红琼脂培养基、PDA 上的生长差异不显著, 结果详见表 1。

2.2 显色培养基质量分析研究计数大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、柠檬酸杆菌和蜡样芽孢杆菌等质控菌株在相应显色培养基和对照培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长的菌落数生长率均大于 0.7, 符合 ISO 国际标准; 选择性质控标准菌株金黄色葡萄球菌、粪链球菌的生长全部被抑制; 各培养基的阴性对照均未见菌落生长, 结果详见表 2。

3 讨论

本研究选择了国内外 4 家培养基生产厂家的霉菌培养基、酵母菌培养基和部分显色培养基, 从质控菌株生长效果、抑菌效果等方面进行质量分析研究,数据表明实验所用培养基质量均符合 ISO 国际标准,试验的 4 家不同培养基厂家生产的这些培养基质量水平不存在统计学上的显著差异(P > 0.05), 这为将新出台的培养基国家标准拟等效采用培养基 ISO 国际标准提供了基础材料和依据。

培养基的 ISO 国际标准有完备的系统性和良好的结果判断可操作性, 且符合我国培养基质量的具体情况, 对于国内的培养基同样是良好的质控标准,有很好的等效性。我国拟基本采用 ISO 培养基标准内容与结构, 综合参考国内外已有的相关培养基标准, 依据我国食品卫生微生物学待检测现实的培养基质量控制的国家标准将出台, 将为培养基厂家和相关部门提供系统而完备的培养基质控依据。