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摘要：目的 探讨生理剂量的雄激素对C57BL/6J雄鼠主动脉血管壁组织线粒体DNA缺失突变的影响。方法 24只8周龄C57 BL/6J 鼠随机分为 3 组，正常组（n=8），去势组（n=8），去势+生理剂量睾酮组（n=8,颈背部皮下注射睾酮（1 mg/kg，每 3天注射1次）；另取8只18月龄的自然衰老组，3个月后测定各组血清睾酮浓度，并提取小鼠主动脉线粒体DNA,用巢氏PCR 技术分析线粒体 DNA 缺失突变率。并将缺失片段经纯化后测序。结果 去势组线粒体 DNA 缺失突变率(36.8475±3.3365%)与正常组(18.1713±2.4317%)相比显著增高，而与自然衰老组(42.3075±3.6556%)相比无统计学差异。去势+T组（23.6488±2.7634%）小鼠的线粒体DNA突变率低于去势组、自然衰老组小鼠，而与正常组之间未见统计学差异。测序显示衰老的主动脉mtDNA存在3713、3864、4236、4415这4种缺失突变，且证实缺失前后有同向重复序列。结论 老年小鼠主动脉mtDNA存在多种缺失突变，缺失率高于年轻组，雄激素缺乏小鼠主动脉mtDNA缺失突变率增加，生理剂量的雄激素可减少小鼠主动脉线粒体DNA缺失突变率。

关键词：主动脉；衰老；去势；丙酸睾酮；线粒体DNA；突变

我国人口老龄化日趋明显，随着经济的发展，提高人群的生活质量，延缓衰老成为社会关注的焦点。线粒体是生命体赖以生存的动力工厂，其对衰老的影响已经得到了广泛认可，mtDNA缺失突变可作为衰老的生物学标志［1］。从机体能量代谢的线粒体着手，从DNA分子水平来探讨抗衰老的方法，具有重要的意义。以睾酮为主的雄激素主要是由雄性动物睾丸分泌，其随着年龄的增长，血清游离以及总睾酮浓度是逐渐降低的［2］，在“衰老过程中性激素的变化及免疫与代谢的调控机制”的“973”项目课题中，已系统证明了性激素失衡参与和诱发了衰老的发生与发展，适当调节性激素平衡有助于延缓衰老。目前已有研究证明一定浓度的睾酮可通过减弱VCAM-1 等多个途径来抗动脉粥样硬化的作用［3-4］，且雄激素具有改善认知能力［5］、炎症反应［6］、抗凋亡、抗氧化系统［7］等作用。但目前尚未见外源性睾酮对去势小鼠主动脉血管壁组织衰老进程影响的文章。本研究旨在探讨生理剂量的睾酮对去势小鼠主动脉线粒体DNA缺失突变的影响，以从一定程度上反映外源性睾酮对主动脉血管壁组织衰老进程的影响。

1 材料与实验方法

1.1 实验动物

32 只 C57BL/6J 小鼠购自南方医科大学实验动物中心，许可证号为：SCXK粤2006-0015。其中24只为8周龄，8只为18月自然衰老小鼠。SPF条件下分笼饲养，自由饮食及饮水。饲养室温度控制在20~26℃、湿度控制在 40%~70%、昼夜时间分别为 14 和10 h 交替。

1.2 试剂及仪器

丙 酸 睾 酮 购 自 广 州 明 兴 制 药 厂（批 号 为070701），睾酮 Elisa 试剂盒购自 R&D 公司，组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司，marker 分别为天根生物有限公司D15000 以及 GenScript Cat.No:M106O, M106R，琼脂糖购自上海生工生物工程有限公司，低温高速离心机购自 Harris 公司、微量分光光度计 ND1000 购自Gene company 、ABI9700 PCR 仪 购 自 ABI 公 司 、BG-Power300 电泳仪购自 Bay Gene 公司、Mini-Pro-tein II 电泳槽购自 Bio-Rad 公司、GDS7500 型密度扫描仪购自UVT公司。

1.3 方法

1.3.1 制作去势小鼠模型 8 周龄的 C57 BL/6J 小鼠腹腔注射80 mg/kg［8］的1.5%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，仰卧固定，充分暴露手术视野，碘酒、酒精分别消毒阴囊及周围皮肤，在阴囊正中线剪开约1 cm。

用眼科镊分离睾丸及附睾外的包膜，暴露睾丸、附睾及周围组织，分离睾丸动脉及精索动脉，夹出双侧睾丸、附睾及睾周脂肪，并结扎血管，之后切除睾丸并缝合阴囊，50000~80000 U/kg青霉素冲洗腹腔后缝合阴囊皮肤，并连续3 d注射青霉素预防感染。

1.3.2 动物分组 24 只 C57BL/6J 小鼠随机分为 3 组，即正常组（n=8）、去势组+安慰剂(芝麻油（)去势组，n=8）、去势+T 组（生理剂量睾酮组，每 3 d 1 mg/kg，n=8）。去势手术后恢复四周予以丙酸睾酮处理用芝麻油稀释，每3 d颈背部皮下注射给药1次。正常组、去势组、予以相同剂量相同部位注射芝麻油给药均为3个月。自然衰老组C57BL/6JJ小鼠，正常饲养至18个月（n=8）。

1.3.3 血清睾酮浓度的检测 各组小鼠处死前于9:00-11:00 间眼球取血，小鼠用 0.15 ml 的 1.5%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉［5, 8］，然后用小镊子摘除眼球取血，血液静置 30 min 后于低温高速离心机以3000 r/min 离心 10 min 提取血清，用 ELISA 试剂盒检测血清睾酮水平。

1.3.4 线粒体 DNA 的制备 按申能博彩公司全基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。分别称取各组小鼠主动脉（质量为0.010 g），将组织块加入300 μl的digestion buffer，剪碎，然后再放入超声波细胞粉碎机进行匀浆，匀浆后将Proteinase K加入匀浆液中混匀，55℃恒温箱中保育，第2将该液体分别离心5 min，取上清液转移至1.5 ml的无菌EP管中，加入300 μl Solution B。将全部样品转移到3S柱，柱子放入2.0 ml收集管，分别加入500 μl wash solution，12000 r/min 室温离心 1 min，重复 2 次。取下 3S 柱，弃去离心管中的全部废液。在柱子中央加入50 μlTE，TE 在恒温水浴箱中预热至 55℃，将柱子放入新的干净的1.5 ml EP管中，室温离心1min。（适当重复可提高产率）收集管中的液体即为模板DNA。用微量分光光度计ND1000测量DNA的含量。

1.3.5 巢氏 PCR 以及普通 PCR 引物的设计合成 从Genbank 中查找出小鼠 mtDNA 全基因序列，参照文献［9］设计引物F1、F2、F3、F4、F5，由上海英骏生物公司广州分公司合成。其中外套引物F1、F2，内套引物为F3、F4，用巢氏PCR扩增缺失型mtDNA片段，F2、F5 用于扩增野生型 mtDNA 片段，反映正常 mtDNA的量。5条引物如下：

F1 5'-TAATTCAAGCCTACGTATTC-3'

F2 5'-GGGATGTTTTTAGGCTTAGG-3'

F3 5'-CAAGTCCATGACCATTAACTGG-3'

F4 5'-GATTTTATGGGTGTAATGCG -3'

F5 5'-CATGATCTAGGAGGCTGCTGACCTC-3'

1.3.6 PCR 扩增 使用 0.25 ml Eppendorf 管进行 PCR标准反应体系，反应体系为25 μl，不足25 μl的均用蒸馏水补足至 25 μl，反应体系均加入 10×LA PCRBuffer Ⅱ（Mg2+Plus）2.5 μl，dNTP Mixture 4 μl，TaKaRaLA Tap 酶 0.25 μl，控制各组模板 DNA 的量保持一致均为87 ng，野生型mtDNA扩增普通PCR：加入引物F2 与 F5，循环条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 5 min，30 个循环；最后一轮循环72 ℃延伸10 min；突变mtDNA的扩增为巢氏PCR，第1轮同样加入模板量为87 ng的DNA，使用引物F1,F2，循环条件为94℃预变性5 min；94℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环；最后1 轮循环 72℃延伸 10 min，第 2 轮使用引物 F3、F4，模板为第一轮产物加入1 μl，循环条件同第1轮。