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                           作者：袁保红，杜青平，邓祖军

【择

【摘要】  目标 说明小连翘(Hyperioums sampsonii Hance)内生真菌的漫衍特性和抗菌活性。要领 回收内生菌疏散法疏散菌株，双作育法坚持试验测定其抗菌性。功效 从小连翘的根、茎、叶等差异的器官中疏散获得81株内生真菌，经形态学分类判断分属于4个目，5个科，26个属，个中头孢霉属（Cephalosporium sp.）和丝核菌属（Rhizoctonia sp.）为上风菌群。差异部位内生真菌的范例、数目和漫衍存在差别，根部有31株，分属于12属；茎部有12株，分属于10属；叶部有38株，分属于13属。通过平板坚持尝试发明，从小连翘所疏散的内生真菌中54.32%对某些植物病原真菌有拮抗活性。结论 小连翘内生真菌及其代谢产品中具有隐藏活性物质，值得深入研究。

【关键词】  内生真菌；小连翘；拮抗活性

　　Studies on communities of endophytic fungi from Hyperioums sampsonii Hance and their antipathogenic activities in vitro

　　Abstract: The endophytic fungi were isolated and identified morphologically from the roots, stems and leaves of Hyperioums Sampsonii Hance. Eighty?one strains of endophytic fungi were isolated and belonged to 26 genera, 5 families and 4 orders. Cephalosporium sp. and Rhizoctonia sp. were the dominant genera. Among 81 strains, 31 strains of 12 genera were isolated in roots, 12 strains of 10 genera in stems, and 38 strains of 13 genera in leaves. The results showed that the quantity, population, and distribution of the endophytic fungi varied in different positions of Hyperioums Sampsonii Hance. In the dual culture tests, 53.48% of all the isolated Endophytic fungi showed antagonistic to some plant pathogens. These endophytic fungi inside the plants have intimate correlation with their hosts. These endophytic fungi and their metabolites might play an important role in the plants against the pathogens.

　　Key words:endophytic fungi; Hyperioums Sampsonii Hance; antipathogenic activities

　　小连翘(Hyperioums sampsonii Hance)，别名小翘、七层兰、瑞香草、元宝草等，为多年生双子叶植物药藤黄科植物，味苦、性辛、平［1］。全草含鞣质，有光致敏浸染，动物食后可发生皮炎；含小连翘碱(hypecorine)和小连翘次碱(hypecorinine)；花含金丝桃素(hepericin)［2］，有活血、止痛、调经、止血、消肿之效；小连翘或其提取物作为有用药物因素用于制备治疗就寝障碍、晚年痴呆、影象力减退等病症的药物［3］；同属植物贯叶连翘，在西方国度称圣约翰草，用于治疗担心症等疾病已有几百年的汗青［4］。连年来的研究表白小连翘也具有抗担心浸染［5］。文献报道，小连翘中含有聚（异）戊二烯二苯甲酮类衍生物、萘骈双蒽酮类和黄酮类等多种化学因素，这些因素是小连翘药理浸染的首要有用因素，可是要提取和疏散这些药物因素尚有许多坚苦［6］。迩来研究表白,某些药用植物中个体内生真菌可以或许发生与宿主沟通可能相似药理活性的因素［7］，由此对药用植物内生真菌的研究引起人们的普及存眷。假如在小连翘内生真菌中可以或许发明相同的活性物质，无疑找到了一种可更换小连翘植物的新型生物资源。可是至今未见从小连翘中疏散及其内生真菌的种群多样性的研究报道。本文对小连翘内生真菌举办了疏散和分类判断，并对其种群多样性及内生真菌拮抗病原菌的活性的研究报道如下。

　　1  原料与要领

　　1.1  原料 疏散所用原料为小连翘的根、茎、叶，采自中国科学院华南植物园（广州）。收罗其康健的组织，无其余病虫害，根、茎与叶分隔收罗，放于密封袋中，于4 ℃存放，尽快举办内生真菌的疏散。 碘伏：威的牌消毒液，首要成份是聚乙烯吡咯烷酮碘（即碘伏），液体剂型，有用碘含量为0.5 %，是一种新型的PVP-I消毒剂，深圳市新华鹏消毒剂有限公司出产。 NS液：0.9 %NaCl；ST液：0.9 %NaCl，0.5 %吐温80；中和剂：0.9 %NaCl，0.5%吐温80，0.5 %硫代硫酸钠。  

　　PDA作育基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000mL，pH7.0。在举办内生真菌的疏散时，向作育基中别离插手青霉素、链霉素至50 μg/mL。

　　1.2  供试菌株 纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)、恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、棉花枯萎病菌 (Fusarium oxysporium f. sp. vasinfectum)由中山大门生命科学院微生物和生化教研室提供。

　　1.2  要领

　　1.2.1  植物原料的处理赏罚 样品采于2005年10月。样品用自来水冲洗干净后，取差异部位的茎或叶多少，剪成小块，别离放于三角瓶中；插手碘伏消毒液（行使时有用碘浓度为2 500mg·L-1），不绝动摇，消毒5 min。吸去消毒液，插手无菌ST液，荡洗1 min，吸去液体。一再一次。经外貌消毒后的样品可用于接种。

　　1.2.2  内生真菌的疏散、纯化 茎内内生真菌的接种：用无菌刀片削去茎的皮及已裸露的切面，然后切取约2～5 mm的切片多少，先置于无菌平皿中。再将样品置于无菌研钵中，插手石英砂和 1 mL ST液，将样品研成浆。取适量的浆液涂布于PDA平板。为了担保样品有足够的代表性，每个样品要用多少段茎，一段茎仅涂一个平板，共需涂5～10个平板。根叶样品的处理赏罚根基同茎。 将涂布好的平板置于28 ℃作育，每隔12 h调查真菌菌落形成环境。作育基中一呈现菌落，当即将此处的小块琼脂挖出，将平板再放回28 ℃作育10 d，计数各平板上的菌落总数。挖出的含真菌的小块PDA当即置于含PDA的小试管中作育，待真菌长出后，再在PDA平板上回收菌丝顶端纯化法慢慢纯化。待菌落呈现后，按照菌落形态、颜色的差别以及长出时刻的差异，别离挑取各平板上的菌落边沿的菌丝接于新的平板长举办疏散作育。在作育数日后，调查菌落的形态及其菌落边沿的整齐环境，并做响应的记录，包罗记忆记录，对菌株编号后，转至PDA斜面作育基上，于28 ℃作育箱中作育5~7 d，然后放入4 ℃冰箱生涯。

　　1.2.3  外貌消毒结果检测 外貌消毒后的样品于5 mL无菌水中振荡1 min，取0.3 mL悬液涂布于PDA平板上，在28 ℃作育，记录是否有真菌发展。其它，回收存活试验调查外貌消毒结果，即将疏散的内生真菌菌苔颠末各自外貌消毒措施处理赏罚后，再接种到PDA平板28 ℃作育后，调查是否发展。

　　1.2.4  菌种判断   从纯化作育数日的菌落上挑取菌丝并连同分生孢子制成玻片，置于光学显微镜下调查菌丝形态、孢子梗形态、孢子形态以及孢子与营养体之间的着生相关，比较有关资料确定真菌的分类学职位［8］。

　　1.2.5  坚持试验   将4栽培物病原菌(纹枯病菌、稻瘟病菌、白叶枯病菌、恶苗病菌)接种于平板中央，内生真菌接种于平板边沿，28 ℃作育，调查病原菌菌落周围的变革。

　　2  功效

　　2.1  外貌消毒结果 外貌消毒后的样品振荡液0.3 mL别离涂布于PDA平板作育基上，28 ℃作育2周后无菌落长出，同时10株疏散的代表性真菌菌苔别离颠末消毒进程处理赏罚后接种到PDA平板上，28 ℃作育2周后，没有调查到菌落发展。表白颠末样品消毒处理赏罚进程，样品外貌附生菌的影响已消除，疏散的菌株来自于样品内部，与植物组织团结细密。

　　2.2  小连翘内生真菌种群构成 从植物小连翘疏散得到内生真菌共81株。经显微形态调查判断为4个目，5个科，26个属（见表1）。从表1可以看出，植物小连翘内生真菌中，从目标分类程度上以丛梗孢目(Moniliales)和无孢菌群(Mycelia sterilia)为上风菌群，别离为50株和23株占总菌株数的61.7%和28.4%；在属的分类程度上以头孢霉属（Cephalosporium sp.）和丝核菌属（Rhizoctonia sp.）为上风菌群，别离为20株和16株，占总菌数的24.7%和19.7%。