视网膜神经节细胞(RGC)是视网膜的第三级神经元，它接受来自双极细胞、无长突细胞及水平细胞的信号，通过神经纤维将视觉信息传导至大脑。如果由于各种原因(如青光眼、外伤、视网膜脱离等)造成RGC损伤、变性或凋亡，将导致视功能的不可逆性损害。由于视神经也是中枢神经的一部分，许多学者把RCC作为神经退行性变及再生研究的模型，用以研究中枢神经系统病变(如阿尔茨海默病、癫痫等)的发生机制［1-3］。但长期以来，神经细胞的不可再生性一直是困扰广大学者们的难题。因此，探索RGC体外培养的有效方法，研究RGC凋亡及损伤后再生的机制，不但有助于研究青光眼等的发病原理及视神经损伤后的修复机制，也为中枢神经系统病变的研究提供了实验基础。我们前期研究表明壳聚糖能够促进混合培养的SD乳鼠视网膜神经细胞的生长［4］。本实验在前期研究的基础上，进一步将壳聚糖应用到分层培养及纯化的RGC中，以便更加准确地观察其作用。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物

生后3d以内的SD乳鼠，雌雄不限，体质量15～20g，由华中科技大学同济医学院动物中心提供。

1．1．2试剂

DMEM/F12培养液(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，多聚赖氨酸(美国Sigma公司)，医用几丁糖(上海其胜生物制剂有限公司，用含体积分数10%血清的DMEM/F12培养基配成浓度为100g•L－1溶液待用)。Thy1．1单克隆抗体(美国Chemicon公司，MAB1406)，单核巨噬细胞单克隆抗体(美国Chemicon公司，MAB1407P)，羊抗鼠IgG(武汉博士德生物技术有限公司)，鼠神经生长因子(NGF，舒泰神生物制药股份有限公司)，噻唑蓝(MTT;武汉博士德公司):配制成5g•L－1溶液待用。1．1．3主要仪器T1-SMNicon倒置相差显微镜及照相系统(日本Nicon光学有限公司)，Nikon数字相机DXM120(日本Nicon光学有限公司)，恒温CO2培养箱(德国Heraeus公司)，Elx800酶标仪(美国BioTek公司)。1．2方法1．2．1实验器皿的制备采用24孔和96孔培养板，用0．1g•L－1多聚-L-赖氨酸(PLL)室温包被孔板过夜后，用PBS漂洗3次，晾干，紫外灯灭菌后备用。在24孔板中置入1cm×1cm的盖玻片，以备细胞免疫组织化学鉴定。

1．2．2RGC的分层制备及培养［5］

取出生3d内SD乳鼠于体积分数75%酒精中处死，无菌条件下取出眼球，PBS冲洗2次。在解剖显微镜下沿角膜缘剪开眼球，依次去除角膜、晶状体及玻璃体，钝性分离出完整的视网膜神经上皮层。镜下可见视网膜神经上皮层由带血管的透明内层和乳白色的外层组成，两层组织疏松附着，可用无齿镊钝性分离出完整的内外层。在内层、外层及全层的视网膜神经上皮组织中分别加入1．25g•L－1胰蛋白酶消化10～20min，至消化液变澄清，胎牛血清终止消化，1000r•min－1离心5min，去上清液，加含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，吸管反复吹打，使细胞分散均匀，制成细胞悬液。计数后以109L－1的密度加入96孔板和预先置入1cm×1cm盖玻片的24孔板内，37℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞生长状态。

1．2．3壳聚糖对各层视网膜细胞生长的影响

培养24h后，将96孔板中的细胞分为100g•L－1壳聚糖组和对照组，前者加入含100g•L－1壳聚糖的培养液，后者只加培养液继续培养，每组各6孔。分别取培养后1d、2d、3d、4d、5d的细胞每孔加入MTT(5g•L－1)溶液10μL，继续培养4h后，去上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μL，振摇10min，使结晶物充分溶解，酶标仪(波长490nm)测量各孔的吸光度(OD)值。每孔测3次，取平均值。

1．2．4细胞免疫组织化学法鉴定

RGC细胞培养7d后，取出24孔板中预先置入的载玻片，PBS洗涤3次，用40g•L－1多聚甲醛室温固定30min，PBS洗涤3次，加入体积分数3%H2O2孵育15min;三蒸水洗涤3次;体积分数5%胎牛血清室温封闭20min，加入一抗Thy1．1(1?100，PBS稀释)，4℃冰箱孵育过夜。同时设立阴性对照组(PBS代替一抗)。PBS洗3次，加入二抗(生物素标记的羊抗小鼠IgG抗体)，室温下作用30min，PBS液洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素30min，DAB显色，蒸馏水浸洗，脱水，透明，封片。在光学显微镜下观察，每层细胞共计数6张玻片，每张玻片计数6个高倍镜视野。根据公式:一个视野中染色细胞数目/该视野总的细胞数目×100%，计算各层细胞的RGC%。

1．2．5RGC的纯化培养

24孔板用多聚赖氨酸包被过夜后，继续用Thy1．1单克隆抗体(1?100，PBS稀释)37℃包被2h备用。单核巨噬细胞单克隆抗体(1?150，PBS稀释)37℃包被直径100mm的培养皿2h备用。将已制好的内层细胞悬液加入已包被抗体的培养皿中，37℃培养箱中培养30min后，将上清液及未吸附的细胞转移至包被Thy1．1抗体的24孔板中，继续孵育30min后，去除上清液及未吸附的细胞。提纯后的细胞分为3组:100g•L－1壳聚糖组、20μg•L－1NGF组和空白对照组，分别加入100g•L－1壳聚糖、20μg•L－1NGF及含体积分数10%血清的培养基培养;观察细胞生长状态，测量每组细胞的最大轴突长度。以形态学标准［6］筛选有活力的RGC:(1)细胞形态清楚;(2)胞体较大;(3)有良好的轴突分支。计算RGC纯化率(%)=一个视野中有活力的RGC数目/该视野总的细胞数目×100%。共计数6个孔，每孔计数6个高倍镜视野。

1．3统计学分析

应用SPSS17．0统计软件进行数据分析。对各层细胞的实验组和对照组采用配对t检验分析，各层细胞每天的存活状态的OD值比较采用单因素的方差分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1分层培养

RGC的生长状态相差显微镜下观察:混合培养的RGC3～4h贴壁，呈圆形，胞体折光性强(图1);1d后可见少许细胞伸出短小的轴突(图2);2d后大多数细胞伸出长短不一的轴突，细胞有聚集成团生长的特性(图3)。随时间延长，轴突增多并不断伸长，有的相互连接。培养1周后，胞体折光性降低，细胞数量逐渐减少，3周后存活细胞已很少。

2．2MTT法检测细胞存活状态

各层细胞的培养中，各时间点100g•L－1壳聚糖组的OD值均高于对照组，其中外层和全层的OD值100g•L－1壳聚糖组与对照组相比差异均有统计学意义(其中t全层=4.88，t外层=6．908，均为P＜0．05)，而内层细胞100g•L－1壳聚糖组与对照组比较差异无统计学意义(t内层=0．492，P＞0．05)。各层细胞中，培养1d、2d细胞活力无明显变化(P＞0．05)，3d、4d、5d细胞活力逐渐下降(P＜0．05;见表1)。各层细胞中壳聚糖组活力均高于对照组，以外层和全层明显。在各个时间点的细胞活力:外层＞全层＞内层。

2．3细胞免疫组织化学法鉴定

RGC培养7d后Thy1．1抗体细胞免疫组织化学显示，RGC染成棕色，胞体呈梭形或多边形，可见胞体伸出长长的轴突(图4-图5)。其中外层视网膜细胞的RGC%为(0．748±0．177)%、全层视网膜细胞的RGC%为(4．986±0．635)%、内层视网膜细胞的RGC%为(19．248±0．999)%。

2．4纯化的RGC生长状况

纯化的RGC3～4h贴壁，1d后可见胞体伸出短小的轴突。培养2d后轴突增粗变长。从形态学观察，100g•L－1壳聚糖组与NGF组的细胞胞体较对照组大，轴突较粗较长，长于对照组(图6-图8)。对照组在第3天活细胞已很少，而壳聚糖组与NGF组可存活至第4天。培养2d后，从形态学标准计数RGC纯化率(图9)，提纯率可达95%以上。

3讨论

为了促进体外培养的RGC的存活，可以采取多种培养方法。在取材上，从最初的直接取视网膜组织混合培养，到后来机械分离视网膜各亚层，直接取RGC层和神经纤维层进行培养［7］。培养方式上，有组织块培养［8］，分散细胞悬液培养，还可以加入各种营养因子［9］或者采取细胞共培养的方法［10］促进RGC的存活。在细胞鉴定和纯化方法上，各种技术也日趋成熟。本实验在前期研究的基础上，采用分层培养的方法，探讨壳聚糖在RGC培养中的作用。

3．1RGC的分层培养及纯化

视网膜神经上皮层由内向外可分为以下9层:内界膜、神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层、外核层、外界膜及视锥视杆细胞层。根据其解剖结构，国外学者很早以前就采用酶消化与机械分离相结合的方法［7］分离出RGC层及神经纤维层细胞进行培养。但该方法操作复杂，耗时长，对操作过程要求十分精细，细胞丢失也较多。由于SD乳鼠视网膜神经上皮层在解剖显微镜下可分为较韧的带血管的内层和较脆的乳白色的外层，我们分别取两层及全层细胞分开培养，7d后用Thy1．1单克隆抗体染色鉴定显示:内层组织的RGC%最高，证实了RGC主要分布在内层，这与视网膜的解剖层次分布是相符合的。这提示我们在以后的研究中，可以直接取内层进行培养以获得较高的RGC%。根据实验结果，本实验直接取内层细胞进行纯化，纯化率可达95%以上。

3．2壳聚糖对体外培养的RGC的促进作用

壳聚糖是广泛存在于自然界的一种生物相容性良好、且具有神经细胞亲和力的多糖类生物大分子。在组织工程的研究中壳聚糖常常被做成支架或膜状物，促进神经组织的修复。Huang等［11］将壳聚糖、纳米碳微管及层粘连蛋白做成纤维膜用于培养嗜铬细胞瘤PC12细胞，发现其轴突能像外周神经纤维一样定向纵向生长，他们的研究发现壳聚糖在促进神经细胞轴突的生长中发挥了巨大作用，这可能与壳聚糖的导电性有关。视网膜神经细胞作为中枢神经系统中的一部分，壳聚糖对其是否也有同样的促进作用呢?Chen等［12］将视网膜祖细胞(RPC)培养在壳聚糖-聚乙酸内酯静电纺丝膜(CS-PCL/PCL)上，RPC能够快速增殖，且更容易向不同的视网膜神经元分化，表明壳聚糖对视网膜神经组织的生长有促进作用。我们在前期研究中［4］，首次将壳聚糖用于视网膜神经细胞的混合培养，结果显示壳聚糖对混合培养的视网膜神经细胞生长有促进作用［4］。本实验进一步将壳聚糖用于视网膜神经上皮的分层培养以及纯化的RGC培养中，从细胞生物学角度研究壳聚糖对视网膜神经细胞的作用。结果显示壳聚糖有类似神经生长因子的作用，能促进纯化的RGC的生长，且对轴突的生长促进作用更明显，表现为轴突更长更粗，分支更多。同时，壳聚糖对分层培养的各层细胞的存活均有促进作用，其中对外层细胞的促进作用最明显，而外层细胞主要是由神经胶质细胞及光感受器细胞组成［7］，表明壳聚糖有利于视网膜神经胶质细胞或光感受器细胞的生长。神经胶质细胞能分泌各种神经营养因子促进视网膜神经细胞的生长［13-14］，因此壳聚糖促进RGC生长或存活的可能机制之一是通过促进神经胶质细胞的增殖间接发挥作用的。这些研究结果为我们以后将壳聚糖用于视神经病变的治疗提供了细胞生物学基础。光感受器细胞的不可逆损伤是视网膜疾病患者视力丧失的重要原因，本研究提示壳聚糖可能有利于光感受器细胞的生长，其具体作用有待于进一步研究。

本实验结果提示我们，对RGC的培养及纯化优先考虑取材视网膜神经上皮内层，同时在培养液中加入壳聚糖有利于RGC的存活和生长，可将壳聚糖作为体外培养视网膜神经细胞培养基的添加物进行推广，这对在体外研究RGC的生化特性及药物毒理非常有帮助。壳聚糖在视网膜细胞损伤后再生与修复的研究中具有良好的应用前景。

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