SPR 在老年痴呆症诊疗中的运用范文

表面等离子共振 ( surface plasmon resonance，SPR ) 是在金属和电介质界面处入射光场由适当条件( 能量与动量匹配) 引发金属表面的自由电子振荡的一种物理现象［1］。基于 SPR 技术的生物传感器能实时监测生物分子间相互作用，且具有无需标记、分析快捷、灵敏度高、前处理简单、样品用量少等优点［1，2］，被广泛 应 用 于 分 子 生 物 学、医 学 及 环境科学等领域［3-6］。阿尔茨海默病( Alzheimer’s dis-ease ，AD ) ，又称老年性痴呆 ，是一种多发生于老年人，以近期记忆障碍为主要临床症状的神经退行性疾病，多在确诊后 8 ～ 15 年死亡［7，8］。诊断 AD 的两个特征性病理改变包括细胞外的由于 β 淀粉样蛋白( beta amyloid，Aβ) 沉积引起的老年斑和细胞内由于微管相关蛋白 tau 异常磷 酸 化 组 成 的 丝 状神经纤维缠结［7，8］。目前，SPR 技术已成功用于以Aβ 和 tau 蛋白为靶标的 AD 发病机制及药物开发研究［9，10］。

1 SPR 的基本原理

SPR是一种物理光学现象。在两种不同折射率的透明介质交界面上，当一束光线从高折射率介质入射到低折射率介质，光线将发生折射和反射。如果入射角超过临界角，入射光线不会进入另一介质，而全部被反射回入射介质中，发生全内反射。但一种叫渐逝波的电磁场会穿过界面渗透到低折射率介质中，且能量呈指数衰减［11］。如果在界面处镀上一层金属薄膜(金膜或银膜)，则金属薄膜表面的自由电子会受入射光激发产生电荷振荡，进而形成表面等离子体并在适当条件下与渐逝波发生能量耦合，形成表面等离子共振现象。此时入射光能量被转移到表面等离子体波中［1］，反射光强度在传播中急剧衰减。使反射光完全消失的入射光角度称为共振角。共振角会随着金属薄膜表面的介质折射率的改变而改变，而折射率的变化与结合在金属表面的分子质量成正比［12］。因此通过分析共振角，可以得到分子间相互作用的信息。图1显示的是在SPR传感器响应周期中发生的生物分子结合与解离事件。在SPR检测过程中，首先要将待研究的靶标分子(ligand，配体或靶标)偶联并固定在金属膜表面，构成传感芯片。然后将与之相互作用的待筛选的目标物(analyte，分析物)溶于溶液(或混合液)流过芯片表面。配体与分析物的相互作用将引起芯片表面折射率的变化，造成共振角或波长的变化。依据这种变化，可实时、动态监测配体与分析物相互作用的整个过程［1，10，13］。

2 SPR 技术在阿尔茨海默病 ( AD ) 相关研究中的应用

AD 是一个慢性神经退行性疾病 ，在此过程中蛋白质的错误折叠( Aβ 和 tau) 导致神经元破坏和损伤、死亡，减少了多种神经递质 ( 主要是乙酰胆碱) 的生物合成，导致多种行为学症状如记忆和认知功能下降［8］。Aβ 聚集和 tau 蛋白异常磷酸化的机制研究以及以此为靶向的药物开发已经是当前关于 AD 的 研 究 热 点［14］。 广 泛 用 于 监 测 DNA-DNA 、DNA -蛋白质 、蛋白质 － 蛋白质以及受体 － 配体相互作用的 SPR 技术在 AD 发病机制研究及药物筛选等领域得到了广泛应用。

2 ． 1 利用 SPR 技术实时监测 Aβ 的自我聚集过程及其动力学特征

4 KD 的 Aβ 肽 ，来源于大的 APP 片段 ，上世纪8 0 年代首次从脑中分离 。 经典的“淀粉样蛋白的级联反应假说( Aβ 假说) ”认为 Aβ 是 AD 发病的上游“启动器”，Aβ 沉积、聚集形成淀粉样斑块，引起神 经 元 细 胞 毒 性 损 伤 及 神 经 元 纤 维［15］。减 少Aβ 产生 、抑制 Aβ 聚集 、促进 Aβ 清除是目前基于Aβ 假说的主要措施［16-18］。Myszka 等［19］采 用 SPR 方 法 实 时 监 测 Aβ 的 聚集过程并进行了动力学分析，他们采用氨基偶联的方法将 Aβ1-40 固化于 CM5 芯片，实时监测与溶液中 Aβ 的相互作用，并通过改变不同的实验参数，包括固化在芯片表面的 Aβ 浓度、分析物浓度，结合相、流速等，研究了 Aβ 纤维形成过程及其动力学特征。这 些 实 验 验 证 了 Aβ 纤 维 形 成 的“dock-lock -block ”模型。图 2 是 Aβ 纤维延伸机制的概略图 ( 上图) 和动力学模拟模型( 下图) 。Cannon 描述，在 Aβ 纤维延伸的过程中，待结合的 Aβ 与已形成的 Aβ 纤维顶端发生可逆性相互作用( dock) ，一旦相互结合，引发时间依赖性的结合反应，Aβ 与纤维整合、异构形成相对稳定的复合物( lock) ，提供新的结合位点以便更多的 Aβ 结合至纤维终端。随 着 后 续 更 多的 Aβ 不断结合，已经结合的 Aβ 肽无法从纤维上解离( block) 。下图则是基于实验数据的动力学过程模拟，包括三步可逆性动力学反应。第一步动力学过程即 dock 过程，这一过程是可逆的，形成不稳定的复合物。随后的第二步和第三步动力学过程均为一级速率过程，结合反应导致 Aβ 异构形成更为稳定的复合物［20］。

2 ． 2 利用 SPR 技术实时监测 Aβ 与其他物质的相互作用

Bohamann 等［21］选择了在血浆和脑脊液中存在的 13 种高丰度蛋白，采用 SPR 方法观察其与 Aβ的相互作用，试图研究这些蛋白质是否影响 Aβ 聚合过程并阐明其可能机制。结果表明，血浆白蛋白( albumin) 能 与 Aβ 纤 维 结 合，并 抑 制 Aβ1-40 与Aβ1 -4 2 的相互作用 ，这一结果通过电镜得到证实 。早在 1996 年，Tjernberg 等［22］利用 SPR 技 术 发现含有 KLVFF( 16-20 残基) 的小分子多肽可以与全长 Aβ 结合。随后，Cairo 等［23］将 Aβ1-35 固化于SPR 传感器表 面 ，观察了KLVFF基序在C端延伸得到的不同长度小分子多肽与 Aβ 的亲和力，并对这些小分子多肽进行了细胞毒性研究，证实了这些小分子多肽与 Aβ 的亲和力。Aβ 能与生物膜结合 ，而且这种结合在介导 Aβ毒性中起重要作用［24］。鉴于生物膜组成和功能的复杂性，直接研究比较困难，评价物质与膜的相互作用、定量评价亲和力大小和结合特异性在技术上极具挑战性。然而，SPR 方法已成功用于研究多肽和蛋白质的相互作用，并为 Aβ 的毒性机制研究提供了新的信息［5，25，26］。Subasinghe 等［27］利用 SPR 方法研究 了 Aβ 与 血 管 平 滑 肌 细 胞 ( vascular smoothmuscle cells ，SMCs ) 质 膜 的 相 互 作 用 ，并 评 价 这 种相 互 作 用 与 Aβ 毒 性 的 相 关 性。 Kremer等［28］在2003年利用L1芯片研究Aβ与膜结合的动力学过程，并将这种方法与脂质体包被的磁珠方法加以比较，结果表明，单体Aβ可以快速、可逆地与脂质双分子层结合，亲和力较低，而聚集的Aβ与脂质双分子层的结合则较慢，但不可逆，再次证明Aβ聚集过程存在理化性质的改变。除了关注Aβ与生物膜的相互作用，大量研究还证实了Aβ与DNA［29］以及朊蛋白［30］等的相互作用。在此基础上，利用SPR技术筛选抗Aβ聚集化合物的工作逐渐开展，skerget监测到stefinB与Aβ1-40的直接相互作用［31］，Canovi等证实抗Aβ1-42单克隆抗体修饰的纳米脂质体与单体及纤维状Aβ1-42的结合［32，33］。一些天然产物与Aβ的相互作用也得以筛选并证实［34-36］。总之，SPR作为工具有力地揭示了Aβ纤维形成的分子特征，并引导研究者设计靶向于抑制Aβ纤维形成或促进其分解的抑制物。

2 ． 3 利用 SPR 技术实时监测 tau 的自我聚集过程和筛选与 tau 相互作用的物质

tau 蛋白是一种微管相关蛋白 ( microtubule asso-ciated proteins ，MAP ) ，主要在 神 经 元 中 表 达 ，在 轴突中含量很高，tau 蛋白可与微管结合组成微管系统，是细 胞 骨 架 的 主 要 成 分［8，37，38］。tau 蛋 白 与 微管相结合，可促进微管形成并保持微管稳定性，降低微管蛋 白 的 解 离［38］。tau 蛋 白 的 结 构 修 饰 主 要有磷酸化、糖 基 化、泛 素 化、氧 化、去 氨 基 化 等 形式，其中磷酸化是目前关注较多的形式，tau 蛋白的主要 磷 酸 化 位 点 在 ser199、ser202、thr205、ser369和 ser404。tau 蛋白过度磷酸化后构象改变，降低了其与微管结合及促进微管组装的能力［37，38］。

细胞内异常过度磷酸化的 tau 蛋白聚集形成的神经纤维缠结( neurofibrillary tangle，NFT) 为 AD 的另一主要病理特征［8］，靶向于 tau 磷酸化的治疗药物开发是 AD 的 研 究 热 点 之 一［14，17］。SPR 技 术 也用于 tau 蛋白的含量测定［39］、自我聚集过程监测［40］以及与其他物质的相互 作 用 研 究［41］。研 究 表 明，tau 蛋白不仅能自我聚集 ，而且在纳摩尔浓度即可与 Aβ1-40 和 Aβ1-42 结合形成可溶性复合物( 见图 4 ) ，继而加速tau和Aβ的聚集过程［41］。Rojo等［42］关于苯并咪唑类衍生物与 tau 蛋白聚集物相互作 用 的 研 究 结 果 表 明，阿 司 咪 唑 ( astemizole，AST ) 和兰索拉唑 ( lansoprazole ，LNS ) 与 tau 蛋白聚集物的亲和力高于其与 AB 聚合物的亲和力，鉴于tau 蛋白在 AD 病理过程中的重要意义以及 AST 和LNS 分 子 量 小 、具 有 良 好 的 血 脑 屏 障 通 透 性 等 特点，Rojo 等［42］认为 AST 和 LNS 可以开发成为靶向tau 的 AD 早期诊断探针和中晚期治疗药物

3 结语

随着人口老龄化程度的加剧，AD 成为人口与健康领域中的重大科学与社会问题，深入研究这一疾病潜在的发病机制并开发出治疗性药物已经成为目前的研究重点和热点［14］。由于前处理简单、耗样量少、实时监测、免于标记等特点，SPR 生物传感器技术为 AD 发病机制研究及药物开发提供了一种新的手段。随着 SPR 传感器和传感芯片的不断发展和完善，结合各个领域研究的拓展，SPR 技术的应用将更加趋向多样化，将极大地促进 AD 的研究进程。

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