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肿瘤血管新生是一个多因素调控，步骤复杂的过程。这一过程包括促血管生成因子的分泌，蛋白水解酶的分泌与激活，内皮外基质降解，内皮细胞迁移，增殖及新生血管成熟 [1] 。大量研究显示植物中的多酚类物质能够抑制内皮细胞的迁移和血管新生，特别是黄酮与 耳酮通过能够调节 VEGF 的表达， MMPs 的表达，和表皮生长因子(epidermal growth factor EGF)受体的表达，从而抑制核转录因子(nuclear factor NF κB)，细胞外信号调节激酶(extracellular signal- regulated kinase Erk1/2)等途径而起到强烈的抗血管新生作用。甘草 耳酮 E 已被发现能够诱导内皮细胞凋亡 [2] ，从而阻断血管新生。甘草中含有许多甘草黄酮与甘草 耳酮，本研究通过比较甘草素（属甘草黄酮）、甘草苷、异甘草素（属甘草 耳酮）、异甘草苷在抗肿瘤血管新生方面的作用，为甘草在肿瘤治疗方面提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 药物和试剂甘草素，甘草苷，异甘草素，异甘草苷（江西本草天工，纯度 >90%）, 融合细胞 Eahy926（兰州大学生命科学学院）；小鼠黑色素瘤 B16 细胞（上海细胞所）；完全培养基（dulbecco's modified eagle's medium DMEM）(sigma);明胶(sigma)；过硫酸铵(sigma)； Tris (sigma)；新生牛血清（杭州四季青），VEGF 试剂盒（上海森雄科技实业）。

1.2 细胞培养 Eahy926 贴壁细胞培养于含 10 %血清，200 万 U.L - 1 头孢 · 2731·现代生物医学进展 www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.10 NO.14 JUL.2010 曲松钠，200 万 U.L - 1 庆大霉素，1.18 g·L - 1 NaHCO 3 ，氢化可的松 10 μg.L - 1 ，EGF 因子 4 μg·L - 1 的 MCDB131 培养液中，置 37℃，5 % CO 2 培养箱中培养。B16 贴壁细胞培养于含 10 %血清，200 万 U·L - 1 头孢曲松钠，200 万 U· L- 1 庆大霉素的 DMEM 培养液中，置 37 ℃，5 %CO 2 培养箱中培养。

1.3 MTT 法测定细胞活性取对数生长期的 Eahy926 细胞稀释至 1×10 5 个 /ml，加 96 孔板，每孔 100 μl，设置对照组（不加药物），空白组（不加细胞） 常规培养 24 h 后弃去培养基，加入不同浓度的无血清药物。继续培养 48 h，向各孔中加入 MTT20 μl(5 mg.ml- 1)，继续培养 4h。吸去上清液每孔加入 150 μl 二甲基亚砜 dimethyl sulfoxide DMSO，震荡 5 min，在 570 nm 处测定吸光值并计算抑制率。抑制率 %=[1- (药物组 OD- 空白组 OD)/(对照组 OD- 空白组 OD)]×100 %.

1.4 划痕实验观察药物对细胞迁移的影响将对数生长期 Eahy926 细胞稀释至 1×10 5 个 /ml，加 48 孔板，每孔 200 μl，放入培养箱中继续培养。当细胞生长至 90 %融合时，用 10 μl 无菌枪头垂直划痕。无血清 MCDB131 洗去漂浮的细胞，加入所用药物使终浓度为 60 μM培养 30 h 后用 PBS 冲洗，拍照，计算愈合率。愈合率 %=(划痕前面积 - 愈合后面积)/ 划痕前面积×100%

1.5 明胶酶谱法、Western-blot 检测药物对 MMP-2 的影响

1.5.1 明胶酶谱 配制浓度为 10% 含 0.1%明胶的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 （sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS- PAGE），将 Eahy926 细胞常规培养至 80 % - 90 %融和时加入无血清药物，终浓度为 60 μM 培养 24 h，收集上清液，细胞计数。取相同细胞数对应上清液电泳。（浓缩胶 40 v，30 min，分离胶 60 v，3 h）。取下凝胶室温下复性液（2.5 % 曲拉通 tritonX- 100，50 mMTris- HCl，pH7.5）中复性 2 h(更换复性液 2- 3 次，以除去凝胶中的十二烷基磺酸钠 sodium alkane sulfonate SDS)，转入 MMP- 2 活化孵育液（50 mM Tris- HCl，150 mM NaCl，5 mM CaCl2，2 μΜ ZnCl2)37 ℃摇床孵育 18 h。0.2 % 考马斯亮蓝 G- 250 染色 2 h，脱色液（35 %甲醇:10 %乙酸)脱色至在蓝色均一背景上出现亮白色条带，拍照并用 Gel- PRO Analyzer 软件(Media Cybernetics, USA)进行分析。

1.5.2 Western-blot 配制浓度为 10 %的 SDS- PAGE 凝胶。将 Eahy926 细胞常规培养至 80 %- 90 %融和时加入无血清药物，终浓度为 60 μM培养 24 h，培养结束后弃去上清，预冷的 PBS 冲洗两次，用预冷的裂解液裂解 30 min(裂解液成份：50 mM羟乙 基 哌 嗪 乙 磺 酸 hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid HEPES pH 7.5，1% Triton X- 100，150 mM NaCl，2 mM Na3VO4， 100 mM NaF，2 μg·ml - 1 抑肽酶 aprotinin，2 μg·ml - 1 亮肽素 leupeptin ，0.2 mg·ml - 1 苯 甲 基 磺 酰 氟 化 物 phenylmethyl sulfonylfluoride PMSF），4℃ 离心细胞 (14,000 ×g，15 min)，用 Bio- Rad 蛋白测定试剂盒测定抽提物总蛋白，取等量总蛋白对应的细胞抽提物，加入 1/4 体积的 5×电泳 SDS- PAGE 上样缓冲液（含二硫苏糖醇 dithiothreitol DTT），沸水浴 5 min 后上样，电泳（浓缩胶 40 v，30 min,分离胶 60 v，3 h）。电泳结束后，将胶条电转移至 NC膜（15 V，30 min）。之后，用 5 % 的脱脂奶粉封闭硝酸纤维素(nitrocellulose NC)膜，4 ℃，过夜。TBST 缓冲液洗膜 15 min（3 × 5 min），室温下用一抗孵育 1 h（r兔抗 MMP- 2 多克隆抗体，1:400），再用 0.1% TBST洗膜 3 次，10 min/ 次。室温下用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育 45 min（抗兔，1: 1000），0.1 %TBST 洗膜 3 次，10 min/ 次。ECL 试剂盒显影拍照，并用 Gel- PROAnalyzer 软件分析结果。

1.6 测定 VEGF 的含量 ELISA 试剂盒检测细胞培养上清中 VEGF 的含量。培养 B16 细胞，待细胞长至 60 %- 70 %融合时，弃去原培养液，以无血清培养液洗涤两次，加入含不同药物的无血清培养液，终浓度为 60 μM继续培养 24 h。收集药物处理后的细胞培养上清液，离心（1 500 g，5 min）取上清，按说明书操作测定细胞培养上清中的 VEGF 含量。贴壁细胞消化后计数。根据标准曲线求出上清中 VEGF 浓度，结果以 1×10 4 个 /ml 细胞分泌的 VEGF （pg/ml）表示。

1.7 统计学处理体外细胞实验时，每个处理至少设 3 个平行，实验均重复 3 次。所有结果以(X±SD)表示，以 t 检验进行组间统计学差异比较，P<0.05 为差异具有统计学意义，P<0.01 为差异具有显著统计学意义，P<0.001 为差异具有极显著统计学意义。

2 结果

2.1 MTT 细胞增殖试验血管内皮细胞能够向着肿瘤的方向迁移并且增殖，形成血管腔，为肿瘤的血管新生提供条件，因此，抑制血管内皮细胞的增殖是抑制肿瘤血管新生的关键之一。