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【摘要】　目的　建立Walker-256大鼠种植瘤模型,研究Walker-256肿瘤对大鼠的Th1/Th2平衡的影响。方法　选取20只雌性SD大鼠,随机分为肿瘤组和对照组。肿瘤组大鼠皮下注射Walker-256肿瘤细胞悬液,建立肿瘤模型,对照组大鼠则皮下注射等量PBS。25天后,检测大鼠血细胞因子(包括IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10)和肿瘤最大径。结果　肿瘤组与对照组比较,肿瘤组IL-12明显下降(P<0. 05), IFN-γ明显下降(P<0. 05), IL-10明显上升(P<0. 01)。以IFN-γ/IL-4代表Th1/Th2,肿瘤组与对照组比较明显下降(P<0. 05)。Th1/Th2失衡与肿瘤生长情况存在相关性。结论Walker-256肿瘤能够导致荷瘤大鼠Th1/Th2失衡。Th1/Th2失衡有利于肿瘤生长。

【关键词】　大鼠;Walker-256;肿瘤;Th1/Th2平衡

CD4+T细胞按产生细胞因子的种类和生物功能可分为2种极不相同的亚群,分别称为Th1和Th2。Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子,可以增强杀伤细胞的细胞毒性作用,激发迟发型超敏反应,介导细胞免疫应答;而Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13等细胞因子,促进抗体的产生,介导体液免疫应答。正常情况下机体的Th1和Th2类细胞因子处于平衡状态,并相互制约,这对于维持机体正常的免疫功能具有重要意义[1]。

1993年,“Th1/Th2漂移”首先在基底细胞癌中发现。此后的研究则表明,很多肿瘤患者体内均存在这种Th1细胞受抑制而Th2细胞占优势的现象,且Th1和Th2的偏移与肿瘤的恶性程度呈正相关[2]。但是荷瘤机体发生“Th1/Th2漂移”的机制尚未明了。因此,我们用SD大鼠和Walker-256肿瘤细胞株建立动物模型,研究Walker-256肿瘤对大鼠Th1/Th2平衡的影响。

1　材料和方法

1. 1　实验动物和细胞株6~8周龄雌性SD大鼠,体重150~180 g由徐州医学院实验动物中心提供;大鼠Walker-256肿瘤细胞株由南京中医药大学药理毒理实验室提供。

1. 2　主要试剂

大鼠IL-12p70ELISA试剂盒,大鼠IFN-γELISA试剂盒,大鼠IL-4ELISA试剂盒,大鼠IL-10ELISA试剂盒由上海西唐生物科技有限公司进口分装。

1. 3　Walker-256冻存细胞株的复苏

取出-80℃冻存Walker-256细胞株的冻存管1只,立即投入37℃水浴中,待其完全融化后,取出冻存管,吹打细胞,将细胞悬液移入15 ml离心管中。轻轻摇晃离心管,缓慢加入PBS至8 m,l其过程持续2min。1 000 r/min离心10 min,弃上清, PBS洗2次。用4 mlPBS重悬细胞,注入4只健康雌性SD大鼠腹腔内,每只1 m,l 7天后可见腹水形成,复苏成功。

1. 4　动物模型及分组

选取20只6~8周龄、体重150~180 g雌性SD大鼠,随机分为肿瘤组和对照组。抽取传代鼠腹水5m,l细胞计数为1×107个/m,l 1 000 r/min离心10min,弃上清,PBS洗2次,再用5 mlPBS重悬,注入肿瘤组大鼠左臀部外侧皮下,每只0. 5m,l对照组则皮下注射等量PBS。10天后肿瘤组大鼠均形成皮下瘤。

1. 5　对大鼠的观察

①于肿瘤种植后第25天,用游标卡尺测量肿瘤组皮下肿瘤的最大径。②同时,两组大鼠均由心脏抽血,分别置于15 ml离心管中, 4℃过夜,于次日上午3 000 r/min离心10min,获取血清,ELISA检测大鼠血IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10。

1. 6　数据处理

采用SPSS 15. 0统计软件进行统计分析,数据以-x±s表示,均数的比较用t检验。

2　结果

2. 1　大鼠一般情况观察肿瘤组大鼠精神萎靡,喜欢扎堆,行动不活跃,毛发蓬松,缺少光泽,从体表就能明显看到肿瘤,个别大鼠肿瘤濒临破溃。其中有1只大鼠在肿瘤种植后第14天死亡,原因为衰竭。对照组大鼠则行动活跃,反应良好,毛发光滑。

2. 2　ELISA检测大鼠血细胞因子结果由于Th1细胞分泌IFN-γ,Th2细胞分泌IL-4,因此用IFN-γ/IL-4代表Th1/Th2,两组血细胞因子及Th1/Th2的比较见表1。

2. 3　相关性分析

肿瘤组相关性分析,发现仅有IL-4、IL-10和Th1/Th2与肿瘤最大径的相关系数有统计学意义,相关系数分别为γ= +0. 753、P<0. 05,γ= +0. 705、P<0. 05,γ= -0. 764、P<0. 05。

3　讨论

为了研究肿瘤对机体免疫功能的影响,就需要用非免疫缺陷的动物来建立肿瘤模型,我们选择了SD大鼠和Walker-256细胞株。SD大鼠属于封闭群动物,其遗传异质性与人类近似[3],免疫功能较为完善。Walker-256原为大鼠自然生成的乳腺癌,在长期传代过程中发现其有部分肉瘤的性质,属癌肉瘤,多用来制作胃癌或肝癌[2]模型。由于皮下种植瘤生长速度较肝癌快,消退率低[4],且便于观察肿瘤生长情况,因此,我们用Walker-256细胞种植于SD大鼠皮下制成皮下种植瘤模型。

我们分别检测了肿瘤组和对照组大鼠的Th1类细胞因子( IL-12和IFN-γ)和Th2类细胞因子( IL-4和IL-10),发现肿瘤组大鼠与正常对照组比较,肿瘤组IL-12和IFN-γ明显下降, IL-10明显上升, IFN-γ/IL-4也明显降低。说明Th1和Th2平衡向Th2方向转移,也就是发生了Th1/Th2失衡,这些情况与临床上发现的肿瘤患者“Th1/Th2漂移”的现象十分相似。

Th1和Th2细胞的极化受其细胞因子环境的影响,并且受抗原提呈细胞( antigen-presenting cells,APC)的调控[5],而树突状细胞(dendritic cel,l DC)则是唯一能激活未致敏T细胞并诱导其极化的APC[6]。根据诱导未致敏T细胞分化为分泌不同细胞因子效应细胞的功能,将它们分为诱导分化Th1的DC1和诱导分化Th2的DC2。大量研究认为,肿瘤能够释放某些产物影响机体的Th1/Th2平衡。肿瘤产生的PGE2[7]和IL-10[5]已经在很多肿瘤中发现。PGE2能诱导DC2分化,而抑制DC1[5]; IL-10则能抑制DC1的成熟[8]。肿瘤产物能诱导外周循环中的和浸润肿瘤的DC1自发性凋亡[9]。DC1和DC2的分布不均衡将影响Th1和Th2的平衡。

IL-12在Th1极化的过程中发挥关键性的作用,其虽然属于Th1类细胞因子,却不是由Th1细胞分泌,而是由抗原提呈细胞(APC)产生,其中主要是DC1[10]。肿瘤组大鼠的IL-12水平明显降低(P<0. 05),提示Walker-256肿瘤能够通过某种机制抑制肿瘤组大鼠体内DC1的分化和成熟,进而影响Th1的极化,最终导致肿瘤组大鼠发生Th1/Th2失衡。因此,肿瘤组大鼠Th1类细胞因子IFN-γ明显下降,而Th2类细胞因子IL-10则明显上升,同时Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)也显著降低。