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作为细胞内的重要一类丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶，可被TNF-α和IL-6激活，加剧中性粒细胞和单核细胞与内皮细胞黏附，加重内皮细胞的损伤 [3] 。实验通过对大鼠动脉血管损伤后不同阶段血清中的相关因子的动态变化，探讨中药对血管组织细胞的保护机制。

1 材料和方法设计：随机对照动物实验。时间及地点：于2008-06/2009-05在辽宁中医药大学动物实验室完成。材料：成年雄性封闭群纯种Wistar大鼠144 只，鼠龄5个月，体质量(270±10) g，购自中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所(动物许可证号：SCKX(京)2005-0013)。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》 [4] 。主要试剂和仪器：实验方法：分组和建模：将144只大鼠随机分为正常对照组，假手术组，模型组和姜黄煎组，每组36 只 [5-6] 。

所有大鼠正常饲养3 d后，模型组与姜黄煎组建立髂动脉内膜损伤模型 [7] ：体积分数 4%的水合氯醛0.6 mL/kg腹腔注射，右侧腹股沟区做切口，暴露股动脉，远心端结扎，近心端用手术丝线拉开，用微型手术剪在在结扎线上方做一横向切口，从切口向腹股沟方向，将长度为2 mm直径为0.138 mm的镍钛记忆合金球囊导丝的导丝插入，深度达股动脉内至髂动脉5 mm处。导丝插入到适当位置后停留1 min，反复重复3次，以造成内膜剥离和动脉血管扩张，随后取出导丝，结扎近心端，松开髂部动脉上的丝线，恢复血流。姜黄煎组在造模24 h 后开始每天予姜黄煎(100 mg/kg)灌胃，模型组给予生理盐水(3 mL/d)灌胃连续14 d，1次/d。假手术组开腹后即缝合，未下导管。正常对照组未给任何处理。分别于3，7和14 d处死动物取材，每个时间点各取12只进行检测。标本的采集、分离及保存：从所有实验大鼠的腹腔静脉采集空腹血5 mL，室温下凝固后离心， 4 000 r/min，10 min。收集血清分装后置于 -80 ℃冰箱保存。测定前2 h放置于室温环境自然解冻，然后迅速开胸取胸腹主动脉交界处 1.0 cm组织置于EP管，迅速置于液氮中，30 min 后-80 ℃保存。用恒冷切片机制成 10 μm的冰冻切片，质量浓度40 g/L多聚甲醛固定20 min，后乙醇梯度脱水，-80 ℃保存。 ELISA检测：采用固相双抗体夹心ELISA方法测定血清MAPK与TNF-α和IL-6水平 [8] 。

实验分组同前，主要步骤：往包被抗p38 MAPK抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗 p38 MAPK抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化作用下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色。颜色的深浅和样品中p38 MAPK的含量呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值(A)，计算样品浓度，以A值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的A值可在标准曲线上查出其浓度。苏木精-伊红染色：分别于建模后3，7和14 d 处死大鼠，取出胸主动脉血管段，置于质量浓度 40 g/L甲醛溶液中固定，石蜡包埋，间断均匀切片，切片厚度5 μm，苏木精-伊红染色，用肉眼倒转接目镜观察玻片内膜组织损伤情况。主要观察指标：大鼠血清丝裂素活化蛋白激酶与TNF-α和IL-6的水平。急性损伤后大鼠血管内膜组织结构的变化。设计、实施、评估者：实验设计为第二作者，干预实施及评估为第一、三、四作者，均受过专业训练，未采用盲法评估。统计学分析：实验计量资料以x _ ±s表示，采用SPSS 10.0统计学软件进行统计学分析，组间差异比较采用单因素方差分析，两样本t 检验，χ 2 检验和SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 在模型制作过程中共试剂及仪器 来源姜黄煎中药煎剂镍钛记忆合金导丝 ELISA 试剂盒酶联免疫检测仪 3550 型辽宁中医药大学附属医院制剂室辽宁中医药大学附属医院介入科北京尚柏生物医学技术有限公司美国 BIO RAD 公司李晓声，等. 姜黄煎剂对内皮细胞组织损伤大鼠丝裂素活化蛋白激酶、肿瘤坏死因子 α 和白细胞介素 6 的影响 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 5235 www.CRTER.org 纳入大鼠144只，均进入结果分析，无死亡、感染及脱落。

2.2 各组大鼠胸主动脉导丝损伤后血管组织形态学改变 见图1。正常对照组大鼠胸主动脉内膜仅见单层内皮细胞，血管管腔内未见明显的形态学改变。见图1a。3 d模型组：可见血管损伤局部內皮脱落和内膜受损。见图1b。 7 d模型组：血管损伤的特征为內皮脱落及內膜、中膜均受损后明显增生狭窄。见图1c。姜黄煎组干预3 d后：姜黄煎组与假手术组与模型组组比较略有缩小(P < 0.05)，局部血管管腔狭窄程度可见减轻。见图1d。姜黄煎组干预7 d后：较损伤后模型组略有缩小，但和正常对照组比较仍有差异，管腔面积明显小于对照未损伤侧(P < 0.05)。见图1e。 2.3 姜黄煎干预治疗后大鼠血清MAPK与TNF-α和IL-6 水平含量变化 见表1。结果提示大鼠血管内膜损伤后可引起炎性因子TNF-α，IL-6不同程度的释放(P < 0.05)，MAPK增加(P < 0.05)，姜黄煎可抑制炎性因子，使TNF-α，IL-6水平下降(P < 0.05)，MAPK下降(P < 0.05)，治疗14 d后，效果更加显著(P < 0.05)。

2.4 各组大鼠胸主动脉导丝损伤后血管组织超微结构改变 见图2。正常对照组皮细胞扁平，胞核椭圆形，核内染色质分布较均匀，胞质内见有核糖体，粗面内质网及较多的囊泡，弹力膜薄厚均匀。见图2a。模型组7 d：内皮细胞柱形不规则，核内异染色质边集，胞膜局部破损，见图2b。姜黄煎组7 d：内皮细胞薄厚不均匀，形状不规则，胞质内见泡样结构。见图2c。假手术组3 d：内皮细胞扁平，胞核表面有切迹，核内异染色质边集，胞质内粗面内质网有扩张，Mi嵴减少。见图2d。

3 讨论

血管内皮组织是循环血液与血管平滑肌间的机械屏障，具有接受、传递信息和分泌血管活性物质等功能，血管内皮组织一旦损伤，就会引起免疫细胞和炎症细胞的活化及多种炎症因子的释放，引发一系列炎性级联反应。因此，修复受损的血管内皮细胞确保内皮细胞完整和功能正常具有重要意义。TNF-α是由活化的单核巨噬细胞产生的一种前炎性细胞因子，对细胞具有直接毒性作用 [8] 。IL-6是炎症反应的中枢性调节者，其可通过体液和细胞免疫功能影响炎症、宿主防御组织损伤。TNF-α 和IL-6均可通过激活MAPK通路转导途径导致内皮细胞损伤 [9] 。

MAPK家族是介导细胞反应的一个重要信号系统，在细胞增殖、分化、凋亡及炎症反应中都起着关键作用 [10] 。多种生长因子、细胞因子和血管活性物质均可激活 MAPK，活化的MAPK通过转位从细胞质进入胞核内活化并启动核内相关基因，转导出相应的mRNA，从而合成IL-6和TNF-α等细胞因子并释放到胞外，引起粒细胞、巨噬细胞趋化聚集，毛细血管通透性增高，淋巴细胞浸润等炎症反应，加重血管内膜的损伤。姜黄素为姜科姜黄属植物姜黄的主要有效成分，现代医学研究揭示，姜黄素可能通过其抗炎的活性基团苯丙酰基而发挥十分广泛的抗炎作用 [11] 。

有学者对败血症大鼠的研究发现，无论在败血症发病前后，静脉注射姜黄素均可以降低血清TNF-α的表达，减少组织损伤和死亡率 [12] 。同样Cho等 [13] 研究发现，姜黄素可以减少TNF-α 诱导HaCaT细胞IL-6产生。本实验以健康成年雄性 Wistar大鼠胸主动脉内皮细胞损伤为基础，从炎性反应的角度，在分子水平探讨姜黄煎剂保护血管内皮组织细胞的机制 [14] 。

因为大鼠是现代医学科研中应用较为广泛的实验动物，所以该实验具有可行性，与其他文献报道基本吻合。实验结果表明，大鼠内皮组织细胞损伤后 MAPK，TNF-α和IL-6的表达明显增高。苏木精-伊红染色结果显示：大鼠动脉内膜损伤后内膜增生在术后早期 (3~7 d) 就已达到高峰，平滑肌细胞增殖、排列紊乱，内弹力层迂曲明显，细胞外基质增加，内皮细胞脱落，而用姜黄煎剂灌胃处理后发现镜下显示内膜脱落减少，受损程度、管腔狭窄程度减轻，MAPK，TNF-α和IL-6 的表达明显降低；说明它在影响MAPK信号转导通路的同时还可以抑制血管壁的炎症反应，具有多方面的保护血管内膜的作用，有一定的临床应用价值；但作为煎剂虽然具有加热时间比较长，药液的浓度较高，能减弱药物本身的毒性并且吸收快，能迅速发挥药效的特点，但其和人为的影响因素也很多，所以实验结果可能存在一定偏倚，值得进一步的探讨。