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阿莫西林杀灭金黄色葡萄球菌的药代动力学和药效动力学关系杨　东,曾振灵,杨雨辉,沈祥广,古小燕,丁焕中*(华南农业大学兽医学院广东省兽药研制与安全评价重点实验室,广东广州　510642)摘要:建立了体外药代动力学和药效动力学(PK-PD)模型,测定了阿莫西林杀灭金黄色葡萄球菌的药代动力学参数和药效动力学参数,并研究了它们之间的关系。结果表明,T>最低抑菌浓度(MIC)是衡量阿莫西林药效的关键指标,当阿莫西林浓度超过MIC时,初始浓度0.4~3.2μg/mL对杀灭金黄色葡萄球菌的药效没有影响。在消除半衰期为2 h的模型内,T>MIC在7.40 h以上时阿莫西林对金黄色葡萄球菌有较好的杀灭效果;在消除半衰期为5.5 h的模型内,T>MIC在11.76 h以上时阿莫西林对金黄色葡萄球菌有较好的杀灭效果。

关键词:阿莫西林;金黄色葡萄球菌;药代动力学;药效动力学

药代动力学(pharmacokinetics,PK)和药效动力学(pharmacodynamics,PD)是临床药理学的两个重要组成部分。PK可以了解抗菌药物在机体血液、其他体液和组织中浓度的高低、扩散速度的快慢及其持续时间;PD则研究抗菌药物发挥药理作用的过程。尽管人们已认识到抗菌药物的PK和PD对于评价临床疗效的重要性,但直到10多年前人们才逐渐了解到PK与PD的复杂关系[1]。以往对抗菌药物给药方案设计的研究,对PK与PD多是分割看待,通常以传统的体外PD参数最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)等作为指导。由于MIC和MBC是将细菌置于固定的抗菌药物浓度中且在人工培养基中测得的,而抗菌药物发挥抗菌活性主要与药物在感染部位的浓度和细菌在体内与药物接触的时间有关,同时体内抗菌药物浓度是一个连续变化的状态,所以传统方法不能体现抗菌药物在体内发挥作用的动态过程,由此得出的给药方案可能不是最佳的[2]。为了准确反映病原菌、宿主和抗菌药物三者之间的关系,近十几年来,许多研究者通过建立体外,半体内或体内药动药效同步模型(PK-PD模型)来研究抗菌药的药效学特征。PK-PD模型的建立和应用对于评价抗菌药物的药效、制定最佳的给药方案、减少耐药性的发生有重要的理论和实际意义。为此,本研究采用体外建立一室模型的方法研究了阿莫西林杀灭金黄色葡萄球菌的PK-PD关系,为提高β-内酰胺类药物的临床疗效,减少耐药性提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　药物及试剂

阿莫西林:批号130409-200208,含量86.2%,购自中国药品生物制品检定所。乙腈为色谱纯试剂;氯化钠、磷酸二氢钾、三氯乙酸、甲醛、乙醚、氢氧化钾等均为国产分析纯试剂。普通营养琼脂、MH肉汤等均为国产生化试剂。

1.2　菌种

金黄色葡萄球菌ATCC25923,为本实验室保存的标准菌株。

1.3　体外药效试验

参考戴自英等[3]的试管2倍稀释法,对其略做改进后,测定MIC和MBC。

1.4　细菌计数

以无菌生理盐水作为细菌计数的稀释液,对菌液进行系列稀释后,取0.1 mL置于普通琼脂平板上,每个稀释度3块板,37℃过夜培养后,对菌数在5~300之间的平板进行菌落计数,取其平均值,单位为CFU/mL。

1.5　体外PK-PD模型的建立

参考Lindecrona等[4]的试验方法,在一个500mL的密闭容器中装入300 mL的灭菌MH肉汤,试验期间持续搅拌容器内的肉汤。该容器相当于药物代谢动力学理论上的一个室。药物浓度的调节通过2个蠕动泵来完成,一个蠕动泵向容器内泵入灭菌肉汤,另一个蠕动泵以相同的速率从容器中泵出肉汤。为防止容器内的细菌泵出容器外,在泵出培养液的蠕动泵的软管前端加一个改造的可换膜的滤器,滤器内加入微孔滤膜。

1.6　体外PK-PD模型蠕动泵流速的确定

蠕动泵的流速根据静脉注射和内服于猪的阿莫西林的消除半衰期(t1/2)进行确定,流速=中央室液体体积(V)×k,k=0.693/t1/2。取1 mL MH肉汤称重,确定MH肉汤的密度。在一定的频率下收集5 min内蠕动泵泵出的MH肉汤,称重。由密度确定体积,由体积确定流速。将频率和流速数据进行线性回归,得出频率与流速方程,以确定所需流速下的频率。

1.7　体外PK-PD模型的试验方法

试验前将模型的密闭容器放入37℃培养箱中预温。试验时,首先将密闭容器放置在磁力搅拌器的加温装置上,使温度保持在37℃。然后将蠕动泵的频率调至所需的数值,并运行稳定。暂停运行,取3 mL对数生长期菌液加入容器中孵育0.5 h。根据体外药效的试验结果,将抗菌药物加入容器内,使容器内药物的初始浓度分别为2、5、8或16 MIC,运行蠕动泵,此时即为PK-PD模型的0时。然后,分别于第0、0.5、1、2、3、4、6、8及12 h取0.5 mL容器内液体进行细菌计数。同时取1 mL液体置于1.5 mL离心管中放入-20℃冰箱中保存,以便进行药物浓度的测定。不同t1/2模型在不同初始浓度药物条件下重复运行3次。

1.8　阿莫西林的测定方法[5]

准确吸取1 mL试验样品置于具有管塞的15mL离心管中,加入20 mL/L的三氯乙酸溶液1mL,旋涡混旋2 min,6 000 r/min离心5 min,吸取全部上清液置于另一15 mL试管中,加入pH2.0的缓冲液1 mL和70 mL/L的甲醛溶液0.5 mL,旋涡混匀。在100℃沸水浴中加热45 min,再立即用冰水冷却5 min,加入0.5 g氯化钠破乳,然后加入5mL乙醚,在振荡器上以每分钟200次的频率振荡20 min,在60℃水浴中用氮气吹干,残渣用0.25mL流动相溶解,经0.22μm的滤器过滤后,取20μL在HPLC上测定。液相色谱工作条件如下:色谱柱为大连依利特Hypersil BDS C18色谱柱(5μm,4.6 mm×250 mm),流动相为磷酸盐缓冲液(pH5·6)-乙腈(二者体积比为80∶20)混合物,流速为1.0 mL/min,荧光检测器激发波长为362 nm,发射波长为435 nm。经笔者测定,阿莫西林在0.03~4.0μg/mL的浓度范围内,标准曲线的线性关系良好,回收率大于75%,日内变异系数小于5%,日间变异系数小于10%。

1.9　数据处理

PK-PD模型中的药代动力学数据用MCPKP药物代谢动力学分析软件计算[6]。药效动力学数据中的杀菌动力学曲线下面积(area under the bacte-rial kill curve,AUBKC)根据两个邻近样品点所围成的梯形面积之和进行计算。AUC0→24的计算方法为: AUC0→24= AUC - AUC24→+∞, AUC24→+∞=C24/k。

2　结果与分析

2.1　体外药效试验阿莫西林对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌活性,MIC为0.2μg/mL,MBC为0.8μg/mL。

2.2　体外PK-PD模型建立的体外PK-PD模型在运行过程中温度和流速稳定,可满足试验的要求。