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酵母多糖是酵母细胞壁的重要组成部分,其是由大分子的甘露聚糖及糖蛋白所组成的复合物,具有较高的营养价值和多种生理活性。酵母多糖具有免疫活性和抑制肿瘤生长等功效[1]。目前酵母多糖在水产养殖领域的应用不多,其对鱼类免疫功能的影响目前国内还未见报导。为此作者以啤酒酵母为材料,提取了酵母多糖,并初步研究了其对鱼类血液NBT阳性细胞(吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞)和血清溶菌酶活力的影响,以此反映其对鱼类非特异性免疫功能的调节作用,为酵母多糖的深层次开发及扩大应用范围提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　试验菌种:啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus),购自中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏中心。

1.1.2　试验鱼类:鲤鱼(CarpioLinn.),取自淡水渔业研究中心,规格为180±10g,雌雄各半。试验前在水族箱中驯养10d以上。每个水族箱有效体积为250L,放鱼10条。试验期间投自制的鱼类配合饵料。

1.1.3　试验用水:曝气除氯的自来水,pH7.2,DO≥5mg/L(试验期间连续充氧),硬度为8德国度。试验水温为20±1℃。

1.1.4　试剂:所用试剂均为国产分析纯。

1.2　方法

1.2.1　酵母细胞壁多糖的提取:参照文献[2]进行。将啤酒酵母培养至对数生长期,4000r/min离心20min,所得沉淀用pH为7.2的0.02mol/L的柠檬酸缓冲液洗涤并形成悬浮液。将悬浮液放入手提式高压灭菌器中高压(1kg蒸汽压,125℃)抽提90min后取出,放冷后再次于4000r/min离心20min。冷至4℃,加入3倍体积的4℃甲醇,出现乳白色沉淀。4℃放置过夜后3000r/min离心20min,得白色沉淀,于干燥器中干燥。重复采用溴代十六烷三甲铵(Sevag法)去除提取物中的游离蛋白,直到蛋白含量恒定为止。再用pH为8.8的1%硼酸溶液提取多糖,沉淀于2%的乙酸溶液中,加入适量乙酸晶体,待充分溶解后,加入3倍体积的乙醇,3000r/min离心20min,收集白色多糖沉淀,干燥后于4℃备用。

1.2.2　多糖含量的测定:采用酚硫酸法。准确称取分析纯葡萄糖20mg于500mL容量瓶中,加水至刻度,此时的葡萄糖标准液的浓度为40μg/mL。分别吸取该溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mL于10mL刻度离心管中,用水将体积补至2.0mL。然后加入6%的苯酚1.0mL和浓硫酸5.0mL,静止10min,摇匀,室温下放置20min,于490nm波长下测定样品的吸光度(用2.0mL水作空白对照)。由样品浓度和吸光度绘制标准曲线。取上述提取的酵母多糖少许,用2.0mL水溶解后按标准曲线的制备方法进行测定,并由标准曲线上求出多糖含量。

1.2.3　鱼类对多糖的摄入:采用注射和投饵2种方式,即每日以体重的0.5%、1%、1.5%、2%作为多糖的摄入量加入饲料中投喂或以5mg/g体重、10mg/g体重、15 mg/g体重、20mg/g体重的剂量进行一次性腹腔注射。分别在试验后的10d、20d和30d取鱼作相应的测定。

1.2.4　溶壁微球菌试验菌粉的配制:斜面上挑取溶壁微球菌,涂布于营养琼脂的平板上,28℃下培养过夜,以制备溶壁微球菌粉末。用无菌重蒸水(D.W.)将溶壁微球菌从营养琼脂平板上洗脱下来,于2500r/min离心15min去上清后用4mL丙酮洗涤细菌,2500r/min离心3min,去上清。重复2次。用4mL乙醚洗涤细菌,2500r/min离心3min,重复1次。把细菌从离心管中取出,放到研钵中,于28℃下干燥3h。把结块的细菌磨成粉末分装小管中,于4℃下保存备用[3]。

1.2.5　鱼类血清和血细胞的收集:从试验鱼的尾静脉采血,将所采全血样本分成2份。一份放入Eppendorf管中用来制备血清,用于测定溶菌酶的活力;另一份用肝素抗凝,取血细胞进行NBT阳性细胞的测定。

1.2.6　NBT阳性细胞的检测:取50μL血细胞于清洁的盖玻片上,在20℃的湿盒中温育30min,用0.067mol/L的PBS(pH6.4)轻洗盖玻片以除去红细胞,然后在载玻片上滴加50μL 0.2g/LNBT(氯化硝基四氮唑兰)溶液,将盖玻片反压在含NBT溶液的载玻片上,于湿盒中温育30min后在40×10的显微镜下观察结果,细胞染成浅黑色的为NBT阳性细胞。

1.2.7　溶菌酶活力的测定:将溶壁微球菌菌粉用0.067mol/L的PBS(pH6.4)缓冲液配成0.2mg/mL的菌悬液,每个样品取3mL菌悬液,加入40μL血清,混匀后立即在540nm下测定反应液的吸光度值A,然后在28℃水浴中放置30min,立即取出转入4℃冰浴以中止反应,再次在540nm下测定反应液的吸光度值B,按公式计算溶菌酶的活力U=(B-A)/B。

2　结果与讨论

2.1　酵母多糖的提取和多糖含量的测定采用柠檬酸缓冲液高压抽提,乙醇沉淀,溴代十六烷基三甲铵去除杂蛋白,硼酸结合沉淀糖蛋白的方法,可得到啤酒酵母的多糖提取物。这种多糖属于蛋白多糖。应用苯硫酸法测定多糖提取物,其多糖的含量为76.2%。在酵母多糖的提取过程中,首先溴代十六烷基三甲铵的用量要适宜,否则会使一部分蛋白质沉淀不完全。其次,多糖提取液中加入硼酸溶液后,溶液的pH值是多糖能否沉淀析出的重要因素。逐滴加入氢氧化钠时务必搅拌均匀,避免局部过碱。至pH8.8时,应立即停止滴加,整个提取过程要尽量避免碱性条件,以免发生β-消除反应,使O-型联键的寡糖链水解下来。若pH超过8.8仍未有多糖沉淀,则表明提取失败。在此应提出的是,应用此方法所得的酵母多糖是不均一的,可用电泳或离子交换柱作进一步分离和纯化。

2.2　酵母多糖对鱼类血液NBT阳性细胞的影响在显微镜下对NBT阳性细胞进行观察,NBT阳性细胞数见表1。从表1可知,采用每日投饵摄入的方式对鲤鱼作用10d后,各试验组一个视野中NBT阳性细胞数为30-32个,与对照组相似;作用20d后达34-38个,而对照组为30个,差异显著(P<0.05);作用30d后仍在上升,达36-40个,与对照组差异显著。采用一次性注射给药的方式对鲤鱼作用10d后,各试验组一个视野中NBT阳性细胞数为34-38个,与对照组差异显著(P<0.05) ;作用20d后为下降为34-36个,作用30d后降为32-34个,与对照组无差异。表1的结果表明,采用一次性注射的方式可使鱼类血液中NBT阳性细胞在短时间内迅速增加,但持续效能不佳。而采用连续投饵的方式可使鱼类血液中NBT阳性细胞在保持一定水平的基础上持续稳定地上升。鱼类血液NBT阳性细胞可综合反映鱼类血液中吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞的水平和功能,是鱼类非特异性免疫系统中的重要指标,因此表1的结果反映出酵母多糖对鱼类非特异性免疫功能有一定的增强作用。