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[摘要]　目的:从细胞途径多方面观察黄连药材、部位及其成分等对3T3-L1前脂肪细胞诱导分化及脂肪细胞胰岛素抵抗的影响,探索黄连改善胰岛素抵抗的药效物质基础。方法:培养3T3-L1前脂肪细胞,采用地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和胰岛素共同诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞,并建立胰岛素抵抗模型。依据黄连传统用药经验,观察黄连“药材-部位-生物碱成分”对脂肪细胞分化的影响,对胰岛素抵抗模型细胞培养液中葡萄糖消耗的影响。结果:除非生物碱部位在6·0μg·L-1具有明显促进分化作用外,其余各组无论黄连水提物、不同提取部位还是不同生物碱成分均能明显抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化,其中单体成分盐酸黄连碱在浓度16·5μmol·L-1时抑制作用最为明显;同时,各组也均能降低培养液中葡萄糖的含量,提高葡萄糖的利用率,改善胰岛素抵抗,作用与马来酸罗格列酮相似,其中单体成分盐酸药根碱在浓度10·5μmol·L-1时改善作用明显优于其余各成分。结论:黄连具有明显改善胰岛素抵抗,抑制前脂肪细胞分化的作用,其疗效可能是各成分协同作用的结果;同时其抑制分化作用也提示黄连在增加细胞对葡萄糖摄取的同时不会引起脂肪的聚集而造成体重增加,这对防治与胰岛素抵抗相关的代谢综合征或并发症具有一定临床意义。

[关键词]　黄连; 3T3-L1前脂肪细胞;药效物质基础;胰岛素抵抗

胰岛素抵抗是多种代谢性疾病的中心环节,也是2型糖尿病发病的重要机制,属于中医“消渴病”范畴。黄连“止消渴”,历代本草医籍多有记载,临床疗效确切。本文依据黄连传统用药经验,从临床有效性出发,首次从黄连“药材-部位-成分”等方面观察对3T3-L1脂肪细胞诱导分化及脂肪细胞胰岛素抵抗的影响,探索黄连“止消渴”改善胰岛素抵抗的药效物质基础。

1　材料

1·1　药物　黄连水提物:称取黄连药材10 g,加10倍量蒸馏水煎煮提取3次,减压浓缩、干燥,收取浸膏。黄连生物碱、非生物碱部位:取黄连水提物,调pH 2~3,加入雷氏铵盐饱和溶液,收集沉淀(滤液作非生物碱部位备用),丙酮溶解,氧化铝柱净化,洗脱液加入硫酸银饱和水溶液分解,氯化钡溶液滤过并除去过量钡离子,滤过,蒸干即得生物碱部位。

以上均由成都中医药大学民族医药学院提供,批号081025。盐酸小檗碱(批号110713-200609),盐酸巴马汀(批号110732-200506),盐酸药根碱(批号0733-200005)均购自中国药品生物制品检定所。盐酸黄连碱和盐酸表小檗碱均为自制,HPLC检测纯度均大于98%。马来酸罗格列酮(ROS)购自葛兰素史克(天津)有限公司。

1·2　细胞株　3T3-L1前脂肪细胞株由四川大学华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室提供。

1·3　试剂　DMEM高糖培养基(Gibco,批号12800-058);优级新生牛血清(中美合资兰州民海生物工程有限公司,批号20081111); 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX, Sigma公司,批号1416651);地塞米松(Dex, Sigma公司,批号D1756);胰岛素(Ins, Sig-ma公司,批号1-5500);油红O(Sigma公司,批号08010);血糖测试试剂盒(四川省迈克科技有限公司,批号010911)。

1·4　仪器　25 cm2培养瓶, 12, 48, 96孔板培养板(美国COSTAR公司);MCO-150A型二氧化碳培养箱(日本SANYO公司); CK40-F200倒置相差显微镜(Olympus); SN-3001酶标仪(Thermo Formo公司); SW-CJ-2F型超净工作台(苏州净化设备有限公司)。

2　方法

2·1　3T3-L1前脂肪细胞的培养和诱导分化　将3T3-L1前脂肪细胞悬液按5×105个/mL接种到48孔培养板,于含质量分数为10%的小牛血清DMEM高糖培养基中,在37℃, 5% CO2,饱和湿度条件下培养, 2 d换液1次。待细胞融合2 d达到接触抑制后,用含1μmol·L-1的Dex, 0·5 mmol·L-1IBMX及5 mg·L-1胰岛素的DMEM完全培养液诱导分化[1], 48 h后撤去Dex和IBMX,用10 mg·L-1胰岛素再继续作用48 h,换正常完全培养液培养8~12d,隔天换液,待3T3-L1细胞90%多呈脂肪细胞表型时用于试验。

2·2　药物对3T3-L1前脂肪细胞诱导分化的影响(油红O法)　待3T3-L1前脂肪细胞达到接触抑制后,用含1μmol·L-1Dex, 0·5 mmol·L-1IBMX及5 mg·L-1胰岛素的DMEM完全培养液诱导分化,方法同2·1。同时分别加入不同浓度的受试药物干预,黄连水提物(30, 6, 1·2, 0·24 g·L-1),不同提取部位(生物碱8, 0·8, 0·08, 0·008μg·L-1与非生物碱60, 6, 0·6, 0·06μg·L-1),以及盐酸小檗碱(50,5, 0·5, 0·05μmol·L-1),盐酸巴马汀(12·5, 1·25,0·125, 0·012 5μmol·L-1),盐酸黄连碱(16·5,1·65, 0·165, 0·016 5μmol·L-1),盐酸药根碱(10·5, 1·05, 0·105, 0·010 5μmol·L-1),盐酸表小檗碱(4, 0·4, 0·04, 0·004μmol·L-1)5种生物碱单体成分,对照组加入等体积溶剂PBS,阳性组加入罗格列酮(20μmol·L-1),每浓度组均设6个复孔,药物与分化培养液同步更换至分化结束。诱导分化结束后,吸去培养液,细胞经PBS清洗3次后,用4%的多聚甲醛溶液固定细胞10 min,吸去固定液, PBS清洗,加入油红O染液室温染色15 min。弃去油红O染液,PBS清洗3次除去多余染液;置显微镜下观察,拍片;加入异丙醇,抽提脂肪细胞中油红O, 510nm测定A,计算细胞分化相对变化率。分化相对变化率=(1-A实验组/A空白组)×100%

2·3　药物对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)模型葡萄糖利用的影响细胞分化完全后,除对照组加入正常培养基,其余各组均加入1μmol·L-1的地塞米松、1μmol·L-1的胰岛素进行脂肪细胞的胰岛素抵抗,作用3 d。待脂肪细胞胰岛素抵抗成立后,换用无酚红DMEM高糖培养基,分别加入不同浓度的受试药物干预3 d,药物同2·2,观察药物对胰岛素抵抗的改善, 72 h后取细胞培养上清液505nm比色测定葡萄糖的含量,计算细胞葡萄糖利用相对变化率。葡萄糖利用相对变化率=(1-A实验组/A空白组)×100%

3　结果

3·1　3T3-L1前脂肪细胞分化前后形态学的变化与比较　未分化的3T3-L1前脂肪细胞呈梭形,胞浆中无脂滴存在,形态与成纤维细胞相似。前脂肪细胞在IBMX,Dex和Ins的共同作用下,逐渐诱导分化为成熟的脂肪细胞,胞浆内出现脂滴,并随着分化程度的加深而积聚增多。油红O为脂肪特征性染色剂,染色后胞浆中的脂滴呈红色。