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夜香树(Cestrum nocturnumLinn, CN)为茄科夜香树属植物, 其花色黄绿或洁白,白昼闭合无香气,夜晚开放且香气浓郁,香味可驱蚊。对CN叶的体外抗肿瘤实验研究结果表明, CN叶提取物具有抗肿瘤作用,并且证明了有效成分主要集中在正丁醇部位[1]。为了探讨其花是否也具有抗癌作用,本实验对CN花提取物进行体外抗肿瘤研究。报道如下。

1　材料与仪器

1. 1　药物CN花采自广西境内,经本学院药用植物教研室刘寿养教授鉴定为茄科属植物夜香树Cestrum nocturnumLinn.;长春新碱(陕西博森生物制药,批号: 20050917)。

1. 2　肿瘤细胞株人胃癌细胞株SGC7901和宫颈癌细胞株He- la购自上海细胞生物研究所细胞库,人肝癌细胞株Hele7404由广西医科大学药理教研室提供。

1. 3　试剂MTT(四甲基噻唑蓝)德国Sigma公司产品,批号: 050609;FBS(胚胎牛血清)杭州四季青生物工程材料有限公司产品,批号: 060226;RPMI1640培养基美国GIBCO公司产品,批号: 1120708;Trypsin(胰蛋白酶)天津市景洋生物制品有限责任公司产品,批号: 00503;DMSO(二甲基亚砜)上海润捷化学试剂有限公司产品,批号: 20051026。

1. 4　仪器CO2培养箱(Thermo Forma)美国产;倒置显微镜(O- lympus),日本产;酶标仪(Biocell),澳地利产;培养瓶美国Pro- mega Corporation产; 96孔板德国产,型号: 3679;培养皿美国产, 型号: 3001;微量加样器日本产,型号:Nichipet。

2　方法

2. 1　提取物的制备[2]CN花晒干后,用乙醇提取浓缩得总浸膏后再用正丁醇回流提取,得到正丁醇部位。

2. 2　MTT法测定[3, 4]取对数生长期的肿瘤细胞,用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调配成浓度为5 000个/m,l接种于 96孔板,每孔加入200μ,l其中包括190μl肿瘤细胞悬浮液和10 μl药液,试药按浓度递增原则各设5个不同的浓度,终浓度分别是为5, 10, 20, 40, 80μg/m,l每种药的每种浓度均设4个平行孔, 空白阴性对照组为等体积的RPMI-1640培养基。在37℃, 10% CO2条件下培养3 d。弃去上清液后,每孔加入200μl浓度为0. 2 mg/ml的MTT溶液(用1640培养基配制),振荡混匀后继续培养 4 h。再弃去上清液,每孔加入200μl DMSO溶液,轻轻振荡使 MTT甲臜沉淀溶解,用酶标仪(波长为550 nm,参比波长为450 nm)测定其OD值,计算抑制率,求IC50。按下列公式计算药物对肿瘤细胞增殖的抑制率。抑瘤率(% )=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值) ×100( 2. 3　集落形成法[3, 5]取对数生长期的肿瘤细胞,用0. 5 ml、 0. 25%的胰蛋白酶消化,细胞计数法后用含10%小牛血清的RP- MI-1640培养液调配成浓度200个/m,l接种于24孔板,每孔加入1 m,l其中包括950μl肿瘤细胞悬浮液和50μl药液,药物的最终浓度为10μg/m,l每种药每种浓度设4个平行孔,阴性对照组加入950μl肿瘤细胞悬浮液和50μlRPMI-1640培养基,摇匀后置37℃、10% CO2培养7d。弃去上清液,用瑞氏染液染色5 min,然后用Giemsa ' s溶液与Sorensen磷钼酸缓冲液以1∶9混合,染色10 min。流水冲洗、凉干,在20×的显微镜下计数含50 个细胞以上的集落,重复3次。按下式计算集落形成率及抑制率。集落形成率(% )=克隆数/接种细胞数×100% 集落抑制率(% )=1-克隆数/对照组克隆数×100%

2. 4　统计学处理以SPSS 10. 0统计软件分析,两组间的均数比较采用t检验。

3　结果

3. 1　MTT法CN花不同提取物对SGC7901、Bele7404和Hela 细胞株增殖的影响结果见表1。表1　CN花不同提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用(-x±s) 组别剂量 C/μg·ml-1 抑制率(% ) SGC7901 Bele7404 Hela 总浸膏5 14. 49 15. 67 9. 41 10 24. 56*29. 14*17. 25 20 42. 27*41. 12*40. 77* 40 60. 51**48. 10**69. 22** 80 71. 41**53. 59**71. 84** 正丁醇浸膏5 8. 57 19. 86 2. 83 10 30. 26*37. 34*30. 96* 20 68. 97*58. 65**61. 66** 40 73. 92**68. 46**73. 20** 80 79. 13**70. 59**85. 19** 　　与空白对照组比较,*P<0. 05,**P<0. 01;n=4 表1结果显示,总浸膏和正丁醇浸膏对3种肿瘤细胞株增殖均有抑制作用,抑制率与空白对照组比较有显著性差异,且抑制率与浓度成正比,其中正丁醇浸膏的抑制作用更为明显。总浸膏对SGC7901、Bele7404和Hela的IC50分别为28. 10, 49. 82, 27. 70 μg/m,l而正丁醇浸膏的分别为18. 44, 19. 00, 19. 49μg/ml。

3. 2　集落形成法CN花不同提取物对SGC7901、Bele7404和 Hela细胞株集落形成的影响。

4　讨论

体外筛选抗肿瘤药物具有用药少、周期短、费用少等优势,且其筛选结果与体内实验的相关性好,因此已被一些研究机构作为常规的抗肿瘤药物初筛手段[6]。MTT法有灵敏度高、稳定性好、快速、操作简便、可评价率高、测定结果客观等优点[7],近年来 MTT法已取得丰硕成果,其方法学日臻完善,更接近临床,更具有实用价值,广泛用于化疗药物筛选和生物学及医学研究中[8]。而集落形成法能反映单个细胞的增殖能力,通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析,能较灵敏地测定抗癌药的活性,目前被认为是一种较理想的检测方法[3]。

实验首先对CN花提取物总浸膏和正丁醇浸膏进行MTT法实验,结果表明总浸膏和正丁醇浸膏对人胃癌细胞SGC7901、人肝癌细胞Bele7404和人宫颈癌细胞Hela的增殖均有抑制作用, 且抑制作用呈明显的剂量关系,尤其正丁醇浸膏的作用明显。在浓度为80μg/ml时,正丁醇浸膏的抑制率约在80%,并且对3种细胞的IC50均小于20μg/m,l而总浸膏的IC50接近20μg/m,l原因可能是总浸膏所含杂质多,也说明了CN花提取物的主要有效成分主要集中在正丁醇部位。按体外抗肿瘤疗效评价规定[9]: 植物粗提物的IC50小于20μg/ml时,则可断定药物在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。通过集落形成法对实验进一步验证,结果也表明其总浸膏和正丁醇浸膏能抑制细胞集落的形成。

CN花提取物在体外实验具有一定的抗肿瘤作用,但其抗瘤作用的真正机理、取物中究竟是何种成分在发挥作用以及体内是否具有抑瘤作用尚不明确,需深入进行研究。实验为对CN花进一步研究提供了一定的理论依据。