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壁虎,别名守宫、壁虎、蝎虎、天龙,味咸性寒,功能祛风,定惊,散结,解毒。壁虎作为药材始见于《本草经集注》,而《本草纲目》就称其能治“瘰疬初起……血积成痞,反胃膈气,痈疮大痛”。其可入血分透筋达络,既善破血散结解毒,又能通经活络而止痛。随着壁虎多种药理活性,特别是抗肿瘤活性被发现后[1],人们对壁虎的关注度日益提高。目前壁虎临床一般以原粉、水煎煮等方法应用,存在服用量大、易被微生物污染等缺点。现代药理研究表明,动物类药材发挥作用的主要为其小分子肽[2~4],因此,我们拟采用酶解方法得到其小分子肽,并与常规原粉和水煎煮液比较其抗肿瘤作用的差异。

1　材料

1. 1　动物昆明种小鼠,雄性,体质量(20±2)g,购自山东中医药大学实验动物中心,动物许可证号为: SCXK(鲁)20050015。S180 腹水小鼠和H22肝癌小鼠均购自山东省医学科学院。

1. 2　仪器JJ-2型组织捣碎机,江苏江南仪器厂;摇摆式高速中药粉碎机,浙江大德中药器械有限公司;W-O型恒温水浴锅,上海申顺生物科技有限公司,TDL-5飞鸽牌离心机,上海安亭科学仪器厂;小型切向流超滤系统,美国Millipore公司(密理博)。 1. 3　试剂及药品胃蛋白酶(酶活力>1 200 U/g),胰蛋白酶(酪蛋白转化力≥25. 0),均购自国药基团化学试剂有限公司,注射用环磷酰胺, 200 mg/支,江苏恒瑞医药股份有限公司,批号: 08051354,氟尿嘧啶注射液(5-Fu),上海旭东海普药业有限公司,批号: 080302。壁虎购自济南兴旺蟾业,经本校周风琴教授鉴定系壁虎科动物无蹼壁虎Gekko swinhonisGunther的干燥全体, 置干燥箱60℃以下真空干燥,粉碎,过80目筛,细粉备用。

2　方法

2. 1　供试品溶液的制备

2. 1. 1　原粉液的制备取壁虎细粉,用0. 2%羧甲基纤维素将其稀释成1 ml∶0. 5 g的混悬液,备用。

2. 1. 2　水煎煮提取液的制备取壁虎细粉,加8倍量水煮沸煮沸 60 min,离心,残渣加8倍量水煮沸30 min,离心,合并上清液,浓缩至1: 0. 5(每毫升药液相当于0. 5 g药材,下同),即得水煎煮提取液。

2. 1. 3　胃蛋白酶酶解液的制备[5]取壁虎细粉90 g,置于组织捣碎器中,加入5倍量水,匀浆(10 000 r/min)10 min,等分为3份, 取1份,煮沸15 min,放冷,调节pH 2. 0,移至37℃恒温水浴锅中,保温10 min,加入1%胃蛋白酶, 2 h后取出,离心(4 000 r/ min)10 min,取上清液,微滤(0. 22μm),超滤(相对分子质量 3 000),收集相对分子质量小于3 000部分,浓缩至1∶0. 5,即得胃蛋白酶酶解液。

2. 1. 4　胰蛋白酶酶解液的制备[6]取“2. 1. 3”项下一份样品液, 煮沸15 min,放冷,调节pH 7. 5,移至55℃恒温水浴锅中,保温 10 min,加入1%胰蛋白酶, 3 h后取出,离心(4 000 r/min)10 min,取上清液,微滤(0. 22μm),超滤(相对分子质量3 000),收集相对分子质量小于3 000部分,浓缩至1∶0. 5,即得胰蛋白酶酶解液。

2. 1. 5　仿生酶解液的制备取“2. 1. 3”项下一份样品液,煮沸15 min,放冷,调节pH 2. 0,移至37℃恒温水浴锅中,保温10 min,加入1%胃蛋白酶, 2 h后取出,调节pH 7. 5,移至55℃恒温水浴锅中,保温10 min,加入1%胰蛋白酶, 3 h后取出,离心(4 000 r/ min)10 min,取上清液,微滤(0. 22μm),超滤(相对分子质量 ·1629· LISHIZHENMEDICINE ANDMATERIAMEDICA RESEARCH 2010 VOL. 21 NO. 7时珍国医国药2010年第21卷第7期3 000),收集相对分子质量小于3 000部分,浓缩至1∶0. 5,即得仿生酶解液。

2. 2　抗肿瘤作用的比较[7]

2. 2. 1　对S180荷瘤小鼠的影响无菌抽取传代8 d的S180腹水小鼠腹腔肿瘤细胞,加入生理盐水调整浓度至4×109个/L,于每只小鼠右腋下注射0. 2 m,l接种140只。接种24 h后,将小鼠随机分为7组,每组20只,即模型组、原粉组、水煎煮组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、仿生酶解组与阳性对照组。模型组灌胃生理盐水10 ml·kg-1,连续10 d;原粉组、水煎煮组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、仿生酶解组均5 g药材·kg-1药液,连续 10 d;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺,剂量30 mg·kg-1,连续3 d;给药量均为10 ml·kg-1。第11天,各组动物颈椎脱臼处死, 剥离肿瘤、胸腺、脾脏,称重,计算抑瘤率、胸腺与脾脏指数,计算公式如下: 抑瘤率(% )=(空白组瘤重均值-样品组瘤重均值) /空白组瘤重均值×100% 胸腺(脾脏)指数=重量(mg) /体质量(g)

2. 2. 2　对H22荷瘤小鼠的影响建模方法、给药方式、剂量均同 S180荷瘤小鼠(对照组为5-Fu, 25 mg·kg-1)。

2. 3　统计学方法实验数据采用SPSS 10. 0统计软件进行分析, 所有测定数值以-x±s表示,采用方差分析法进行分析,P<0. 05 为有显著性差异,P<0. 01为有极显著性差异。

3　结果

3. 1　对S180荷瘤小鼠的影响

3. 1. 1　对S180荷瘤小鼠抑瘤率的影响结果见表1。结果表明,各酶解组的抑瘤率较原粉组及水煎煮组有明显提高,与模型组相比有显著性差异(P<0. 05),环磷酰胺组与模型组相比有极显著性差异(P<0. 01)。酶解各组抑瘤率比较,仿生酶解组>胰蛋白酶酶解组>胃蛋白酶酶解组。原粉组与水煎煮组均具有一定抗肿瘤作用。

4　讨论

壁虎在临床上常用于肿瘤,特别是消化道肿瘤的治疗,一般焙干研细或水煎煮入药,但壁虎起抗肿瘤作用的物质基础还不清楚。小分子肽抗肿瘤作用逐渐引起了人们的注意。越来越多的研究表明,动、植物含有小分子肽具有很好的抗肿瘤作用,世界上许多国家正在竞相研究开发小分子肽类抗肿瘤的防治药物,如谷胱甘肽、海参五肽、槲寄生肽、胸腺五肽等[8, 9]。本研究运用酶解的方式,使壁虎含有的蛋白类成分酶解成小分子肽,对其抗肿瘤作用进行研究。研究结果表明,壁虎经酶解后的抗肿瘤作用明显高于原粉组与水煎煮组。本实验中的壁虎仿生酶解是指模拟人体消化过程,先用胃蛋白酶酶解,再以胰蛋白酶酶解的方法,对壁虎药材进行酶解。小分子肽的界限划分迄今未有明确定义,鉴于国内外热门研究小分子肽的相对分子质量都在3 000以下[10],本实验中3种酶解液均为经过超滤所得的相对分子质量小于3 000的小分子肽。