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系菊科旋覆花属植物,为多年生草本,性温,味辛、苦,在我国分布于新疆,其他许多地区常有栽培;其根供药用,有些地区用土木香代替青木香。土木香具有健胃、利尿、祛痰和驱虫等功效[1]。目前已从土木香中分离得到土木香内酯、异土木香内酯和二氢土木香内酯等多种成分,具有抗肿瘤、抗炎、驱虫、抗菌、降血糖和镇痛等多种活性[2-3]。为较系统地研究异土木香内酯的抗肿瘤活性,本实验室采用体外培养的人小细胞肺肿瘤细胞株和人非小细胞肺肿瘤细胞株以及小鼠移植性肿瘤模型对从土木香根中纯化的3种倍半萜内酯化合物进行了体内外抗肿瘤活性研究,并探讨了这3种化合物结构与活性之间的关系及可能的作用机制。

1　材料

1·1　药物:3种倍半萜类化合物,异土木香内酯 (isoalantolactone,1),2-羟基-11,13-二氢异土木香内酯(2-hydroxy-11, 13-dihydroisoalantolactone, 2)和11,13-二氢异土木香内酯(11,13-dihydroi- soalantolactone,3)由河北医科大学药学院史清文教授从土木香的根中分离得到,均为白色针晶,经一维和二维核磁共振光谱和质谱确定结构,经HPLC 和1H-NMR检查,质量分数在99%以上。

1·2　试剂:MTT (Sigma); RPMI 1640培养基 (Gibco);顺铂(Sigma,批号034k3693)。

1·3　细胞系和实验动物:人非小细胞肺肿瘤细胞株 (A549、RERF-LC-jk、QG-56)以及人小细胞肺肿瘤细胞株(PC-6、QG-90)由日本千叶大学医学部第二生物化学教研室提供;仓鼠肺成纤维细胞(CHL) 由河北医科大学基础医学院细胞生物学实验室提供。各细胞株接种于直径为100 mm的培养皿中, 加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,37℃ 和5% CO2培养箱中培养。实验用小鼠为昆明小鼠,体质量18~22 g,合格证号冀动字805213号, 河北医科大学实验动物中心提供。

2　方法

2·1　体外抗肿瘤细胞或CHL增殖活性:参照文献方法[4]。细胞接种于96孔板,每孔含1×104个细胞,分别加入溶剂(终体积分数0·1% DMSO)、阳性对照药物顺铂、紫杉醇和化合物1~3,终浓度分别为100、10、1μmol/L,每组设3个复孔,置于饱和 湿度、37℃和5% CO2培养箱中培养48 h。于培养结束前4 h,各培养孔加入5 mg/mL MTT,测定各孔吸光度(A)值,测定波长570 nm,参考波长630 nm, 计算细胞增殖抑制率及半数抑制浓度(IC50)值。增殖抑制率=(1-给药组A值/对照组A值)×100%

2·2　体内抗肿瘤活性:参考文献方法[5],制备移植性肝癌H22小鼠模型,取小鼠腹腔传代的处于对数生长期的肝癌H22细胞,计数后用无菌生理盐水调细胞浓度为5×107/mL,接种于小鼠右前肢腋窝皮下,每只0·2 mL,即1×107个细胞,接种1 d后,随机分组,每组10只。模型组ig给予水(0·2 mL/10 g);环磷酰胺组ip环磷酰胺(30 mg/kg);给药组分为1、10、100 mg/kg 3个剂量组,ig给予相应药物 (0·2 mL/10 g),每日给药1次,连续10 d。第10天处死小鼠,迅速剥取瘤块、胸腺和脾脏,称取瘤质量、胸腺和脾脏质量,计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数。　　抑瘤率=(1-给药组瘤质量/模型组瘤质量)×100% 　　胸腺(脾)指数=1 000×胸腺(脾)质量/体质量

2·3　统计学处理:数据用x±s表示;两组间数据用t检验;多组间数据用单因素方差分析。应用 SAS612统计软件计算。

3　结果

3·1　化合物1~3对体外培养的人非小细胞肺肿瘤细胞A549增殖的抑制作用:结果见图1,阳性对照药物顺铂和紫杉醇对A549细胞增殖显示较强的抑制活性,对A549细胞增殖的IC50分别为8·48、 14·54μmol/L;100μmol/L化合物1(异土木香内酯)对A549肿瘤细胞的抑制率为88·93%,IC50仅为1·51μmol/L,低于阳性对照顺铂和紫杉醇,并且与溶剂对照组相比较差异极显著,提示异土木香内酯具有较强的抑制人肺肿瘤细胞增殖的作用。但是 100μmol/L与异土木香内酯结构相似的化合物2 和3处理A549细胞,对其增殖均显示较弱的抑制性,其IC50均大于100μmol/L。

3·2　化合物1对其他4种人肺肿瘤细胞增殖活性的影响:结果见图2,阳性对照顺铂和紫杉醇对人非小细胞肺肿瘤细胞(RERF-LC-jk和QG-56)的增殖显示较弱的抑制活性,对人小细胞肺肿瘤细胞 (PC-6和QG-90)的增殖显示较强的抑制活性,IC50 仅为24·62、8·95、4·53、0·32μmol/L;化合物1除对PC-6的增殖显示中等的抑制活性,对RERF- LC-jk、QG-56和QG-90细胞的增殖均有较强的抑制活性,其IC50分别为7·23、4·29、3·70μmol/L。用100μmol/L化合物2和3处理其他4种实验用人肺肿瘤细胞,对其增殖均显示较弱的抑制活性, IC50均大于100μmol/L。与溶剂对照组比较:*P<0·05　**P<0·01 *P<0·05　**P<0·01vssolution control group 图1　3种倍半萜内酯化合物对人肺肿瘤细胞 A549增殖的影响 Fig.1　Effect of three sesquiterpene lactones on proliferation of human A549 tumor cell line

3·3　化合物1对小鼠移植性肿瘤H22生长活性的影响:结果见图3,环磷酰胺显著抑制小鼠肝癌 H22,抑瘤率为67·56%,化合物1100、10 mg/kg剂量组可显著抑制小鼠肝癌H22的生长,抑瘤率分别为65·50%、42·97%、100mg/kg剂量组与模型组 A-RERF-LC-jk　B-QG-56　C-PC-6　D-QG-90 与溶剂对照组比较:*P<0·05　**P<0·01 *P<0·05　**P<0·01vssolution control group 图2　化合物1对其他4种人肺肿瘤细胞增殖活性的影响 Fig.2　Effect of compound 1 on proliferation of other four human lung tumor cell lines ·1337·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第41卷第8期2010年8月相比差异显著(P<0·01),并呈现较好的剂量依赖关系。与模型组相比,环磷酰胺组的胸腺脂数和脾指数非常显著降低(P<0·01),但化合物1各剂量组的胸腺指数以及脾指数与模型组相比无显著差异。与溶剂对照组比较:**P<0·01 **P<0·01vssolution control group 图3　化合物1对小鼠肿瘤H22生长的影响 Fig.3　Effect of compound 1 on H22growth in mice

3·4　化合物1对体外培养的CHL细胞增殖活性的影响:以CHL细胞为对象,考察化合物1对正常细胞的毒性,结果见图4,阳性对照顺铂对CHL细胞增殖呈现较强的抑制活性,IC50为18·34μmol/ L,而用100μmol/L化合物1处理CHL细胞,其增殖抑制率为46·33%,化合物1对CHL的IC50大于 100μmol/L,显示较弱毒性。与溶剂对照组比较:*P<0·05　**P<0·01 *P<0·05　**P<0·01vssolution control group 图4　化合物1对CHL细胞增殖的影响 Fig.4　Effect of compound 1 on CHL cell proliferation

4　讨论　　

近年来肺癌的发生率和死亡率逐渐升高,并且发病年龄逐渐年轻化。化学治疗在肺癌尤其是小细胞肺癌和晚期肺癌患者中占据重要地位,而目前临床上肺癌化疗仍以铂类、紫杉烷类和长春新碱类为主,但是因其不良反应较大,限制了其广泛应用,所以寻找高效低毒的新的抗癌药物对于肿瘤治疗具有重大意义。